[發明專利]一種雙熒光蛋白分子細胞標記的方法

無效

• 申請號: 200810036837.6
• 申請日: 2008-04-30
• 公開（公告）號: CN101570758A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 楊淑偉;黃文韜
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/65;C12N5/10
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 繆利明

1、一種用于雙熒光標記方法的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒包括：

1)編碼標簽蛋白A的DNA片段A，該標簽蛋白可以特異地與其熒光底物共價結合，其5’端或3’端融合一段編碼待檢測蛋白C的DNA序列C，組成片段AC；

2)編碼標簽蛋白B的DNA片段B，該標簽蛋白可以特異地與其熒光底物共價結合，其5’端或3’端融合一段編碼待檢測蛋白D的DNA序列D，組成片段BD；

3)所述片段AC與BD由一段編碼內部核糖體插入位點元件的雙順反子ORF表達系統的DNA序列E連接；

4)在所述片段AC的上游的合適位置的一段負責所述片段AC、E和BD的轉錄控制的啟動子。

2、如權利要求1所述的重組質粒，其特征在于，所述標簽蛋白包括SNAP、Halo。

3、如權利要求1所述的重組質粒，其特征在于，所述片段C和D可以是任意不同的細胞中的存在的或者是合成的可以翻譯為多肽的DNA片段，所述標簽蛋白A，B為SNAP和Halo，所述表達系統序列為IRES。

4.如權利要求3所述的重組質粒，其特征在于，所述待檢測蛋白為pTOM20和LEF1，所述標簽蛋白為SNAP和Halo，所述表達系統序列為IRES。

5如權利要求4所述的重組質粒，其特征在于，所述用于雙熒光蛋白分子標記方法的重組質粒為pTOM20-SNAP-IRES-LEF1-Halo重組質粒，其序列如SEQ?ID?NO：1所示。

6、如權利要求1-5中任一項所述的重組質粒，其特征在于，所述載體為pIRES載體。

7、一種雙熒光蛋白分子細胞標記的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A)構建如權利要求1-6中任一項所述的用于雙熒光蛋白分子標記方法的重組質粒；

B)細胞轉染；

C)熒光標記。

8、如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述pTOM20-SNAP-IRES-LEF1-Halo重組質粒構建包括以下步驟：

a)將LEF1片段聯接到具有Halo的pFC14A載體中，獲得pFC14A-LEF1重組質粒；

b)將LEF1-Halo片段加入到pIRES載體中，獲得IRES-LEF1-Halo重組質粒；

c)將SNAP?tag片段加入到IRES-LEF1-Halo重組質粒中，獲得SNAP-IRES-LEF1-Halo重組質粒；

d)將TOM20片段加入到SNAP-IRES-LEF1-Halo重組質粒中，獲得TOM20-SNAP-IRES-LEF1-Halo重組質粒。

9、如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述LEF1片段、SNAP?tag片段和TOM20片段通過PCR擴增獲得。

10、如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述LEF1-Halo片段通過酶切pFC14A-LEF1重組質粒獲得。