[發明專利]一種重組人釉原蛋白及其制備方法

無效

• 申請號: 200810036471.2
• 申請日: 2008-04-22
• 公開（公告）號: CN101565463A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 束蓉;程嵐
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙)
• 代理人: 翟 羽

技術領域

本發明涉及一種蛋白，尤其是涉及一種重組人釉原蛋白及其制備方法。

背景技術

釉基質蛋白(enamel?matrix?proteins，EMPs)是牙齒發育到鐘狀期，由內釉上皮細胞分化而來的成釉細胞合成和分泌一系列細胞外基質蛋白。自1975年首次提出來自赫特威氏上皮根鞘的釉質相關蛋白可以誘導牙根部無細胞性牙骨質形成以后，體外實驗和臨床治療廣泛證實EMPs能有效促進牙周韌帶、牙骨質、牙槽骨再生，形成類似正常的牙周組織的排列，達到真正的牙周再生。發育中EMPs最主要的成分——釉原蛋白(amelogenin，Am)，也是EMPs中促進牙周再生的主要活性成分。但Am的組成不是單一的，至少有9種成分，分子量范圍5～27kD。目前廣泛應用于牙周再生的基礎研究和臨床應用的EMPs基本為提取的豬釉基質蛋白，其主要的成分是分子量為20kD、13kD、11kD的Am?，F有的唯一釉基質蛋白市售商品——的有效成分也是從豬牙胚組織中提取的釉原蛋白的衍生物。

目前國內尚未見有人工合成的單一組分的人Am。Am是成釉細胞中Am基因的表達產物。人有兩個Am基因，一個定位于X染色體p22.1-p22.3區域，另一個在Y染色體q11處。逆轉錄PCR證實主要的轉錄本來自于X染色體。人Am基因至少包括7個外顯子，存在至少有9種選擇剪切的方式，編碼的九種不同Am在組織中的含量并不相等。剪切去掉外顯子4是最常見的一種剪切方式，由它編碼的Am在發育的釉質中最多見。研究證實成熟的人Am的主要成分是X染色體上Am基因的翻譯產物——由175個氨基酸殘基組成的Mr1.96×10⁴蛋白。

發明內容

本發明的目的在于：

(1)提供一種重組人釉原蛋白；

(2)提供一種重組人釉原蛋白制備方法。

本發明的技術方案如下：

1、一種重組人釉原蛋白，通過下列方法制得：

a、克隆X染色體編碼的人釉原蛋白成熟肽基因hAm；

b、構建含有上述基因的重組原核表達質粒PGEX4T1-hAm；

c、將步驟b獲得的重組原核表達質粒PGEX4T1-hAm轉化表達菌株E.coli.Rosetta；

d、誘導步驟c獲得的克隆表達菌株表達融合蛋白GST-hAm；

e、通過GST親和層析純化融合蛋白。

在步驟a中克隆位點的兩個內切酶EcoR?I和Sal?I作為將目的基因克隆入載體的內切酶。所述內切酶EcoR?I和Sal?I酶切位點的引物序列如下：Am-EcoR?I?5’CCG?GAA?TTC?ATG?CCT?CTA?CCA?CCT?CAT?CCT?G3’；Am-Sal?I?5’ACGC?GTC?GAC?TTA?ATC?CAC?TTC?CTC?CCG?CTT?G3’。步驟a所述的人釉原蛋白成熟肽基因由人X染色體編碼，來源于人胚胎的乳牙牙胚組織，步驟b所述的重組原核表達質粒是將人釉原蛋白成熟肽編碼序列插入原核表達質粒PGEX4T1而得到的，步驟c所用的是專門用于含有稀有密碼子的真核蛋白在大腸桿菌中的表達宿主菌E.coli.Rosetta，步驟d所述的含有重組質粒的克隆表達菌株用異丙基硫代-β-D半乳糖苷誘導表達融合蛋白GST-hAm，步驟e所表達的融合蛋白通過GST親和層析純化。

2、一種重組人釉原蛋白的制備方法，包括以下步驟：

a、克隆X染色體編碼的人釉原蛋白成熟肽基因hAm；

b、構建含有上述基因的重組原核表達質粒PGEX4T1-hAm；

c、將步驟b獲得的重組原核表達質粒PGEX4T1-hAm轉化表達菌株E.coli.Rosetta；

d、誘導步驟c獲得的克隆表達菌株表達融合蛋白GST-hAm；

e、通過GST親和層析純化融合蛋白。