[發明專利]利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法

無效

• 申請號: 200810035831.7
• 申請日: 2008-04-10
• 公開（公告）號: CN101260432A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發明（設計）人: 董德賢;周科軍;李榮秀;陳德兆
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/44
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1、一種利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，其特征在于包括如下步驟：

第一步：捕獲探針的固定：將5’端標記有生物素的捕獲探針固定于預先包被有鏈親和素的酶標板上；

第二步：細胞破碎和胞內RNA的釋放：采用超聲破碎法，在裂解雜交液中加入甲酰胺和酵母tRNA，使裂解雜交液能夠失活RNA酶，保護目標RNA不被降解，同時不會引起后續S1酶的活性喪失；

第三步：信號探針與目標RNA雜交：取超聲破碎后的裂解雜交液，加入信號探針，變性后雜交；

第四步：S1酶消化多余探針：第三步雜交完成后，加入S1酶消化液，S1酶能夠將游離的信號探針、RNA以及RNA/信號探針雜交體的單鏈部分消化，剩下與目標RNA完全互補的RNA/信號探針雜交體；

第五步：捕獲探針與信號探針結合：S1酶消化反應完成后，往體系中加入變性液，變性解離目標RNA/信號探針雜交體，將變性后的溶液加入到第一步固定好捕獲探針的酶標板中進行捕獲探針與信號探針的雜交反應；

第六步：信號檢測：第五步雜交完成后，利用辣根過氧化物酶催化的顯色反應來放大信號。

2、如權利要求1所述的利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，其特征是，第一步中，固定的捕獲探針的濃度在5nM-50nM。

3、如權利要求1或2所述的利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，其特征是，第一步中，捕獲探針與信號探針是一對互補探針，其長度在于35nt-45nt，信號探針和捕獲探針的5’或3’端帶有標記物，標記物為地高辛、生物素、熒光素中的一種。

4、如權利要求1所述的利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，其特征是，所述的裂解雜交液是指菌體超聲破碎和信號探針與目標RNA雜交的溶液環境。

5、如權利要求1或4所述的利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，其特征是，第二步中，所述裂解雜交液，其組成成分是：80％體積比的甲酰胺，400mM的氯化鈉，5mM的Na₂EDTA，1％的十二烷基磺酸鈉以及0.5％的酵母tRNA。

6、如權利要求1所述的利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，其特征是，第三步中，所述變性后雜交，是指在95℃變性5min后雜交。

7、如權利要求1所述的利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，其特征是，第四步中，所述的S1酶消化液，是指含有S1酶的，加入到雜交后的溶液中消化游離信號探針、RNA以及RNA/信號探針雜交體的單鏈部分。

8、如權利要求1或7所述的利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，其特征是，第四步中，所述的S1酶消化液，其組成如下：2U/μl的S1酶，25mM的ZnSO₄，50mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH4.2。

9、如權利要求1所述的利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，其特征是，第五步中，所述變性液，其組成為：62.5mM氫氧化鈉，30mM?Na₂EDTA、149mM?Na₂HPO₄和351mM?NaH₂PO₄，pH?7.2。

10、如權利要求1所述的利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，其特征是，第六步中，信號檢測具體操作為：用含0.5％的土溫-20的磷酸緩沖液洗滌酶標板，然后加入辣根過氧化物酶標記的抗熒光素抗體與信號探針上標記的熒光素結合，用含0.5％的土溫-20的磷酸緩沖液洗滌后加入TMB顯色液進行顯色反應，反應終止后進行信號檢測。