[發明專利]利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法

無效

• 申請號: 200810035831.7
• 申請日: 2008-04-10
• 公開（公告）號: CN101260432A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發明（設計）人: 董德賢;周科軍;李榮秀;陳德兆
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/44
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種檢測方法，具體是一種利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

發展一種能夠快速、靈敏、可靠基因檢測方法得到了越來越多的重視。傳統的Northern雜交和狹縫雜交需要太長的時間，同時操作十分復雜。近年來發展起來的基因芯片技術，盡管能夠高通量的檢測基因表達，但是是一種成本很高的方法。熒光定量PCR技術具有很高的檢測靈敏度，它需要純化質量非常高的RNA，不然會抑制后續的反轉錄和PCR反應。三明治雜交技術檢測快速，甚至無需核酸純化，在檢測的特異性方面有所欠缺。

S1酶是一種從米曲霉Asperillus?oryzae分離出來的單鏈特異性核酸內切酶，分子量為32KD，在低pH值環境(pH值4～4.5)作用，需Zn²⁺參加。熱穩定性好，在底物存在的條件下，65-70℃還有活性。一般僅作用于單鏈DNA或RNA，或雙鏈核酸中的單鏈區，產生帶5′-磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。具有高度的單鏈切割特異性，廣泛用于SNP(單核苷酸多態性)的檢測。

經對現有技術的文獻檢索發現，中國專利公開號：CN?100352937C，發明名稱：對藻類進行定性與定量分析的方法，該發明提出了一種針對rRNA的S1酶保護分析探針和夾心雜交技術，用來檢測海洋藻類的種類和數量，但是該方法所用到的夾心雜交技術步驟比較繁瑣，而且所采用的探針數量多，增加了檢測成本。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種利用S1酶切割單鏈核酸特性的RNA定量檢測方法，使其利用S1酶的單鏈切割特性，開發了一種無需RNA純化，具有高度特異性的RNA快速檢測方法。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明具體包括以下步驟：

第一步：捕獲探針固定：將5’端標記有生物素的捕獲探針固定于預先包被有鏈親和素的酶標板上。此一步驟的關鍵是固定的捕獲探針的量要適中，太少的探針會導致檢測信號太小，監測范圍減小；太多的捕獲探針會造成材料的浪費，同時捕獲探針之間會有一定程度的結合，對檢測不利。本發明固定的捕獲探針的濃度在5nM-50nM。

捕獲探針與信號探針是一對互補探針，其長度在于35nt-45nt。探針長度增加會延長雜交時間，探針長度太短不能保證足夠的特異性。信號探針與目標RNA的某一特定區域互補。信號探針和捕獲探針的5’或3’端帶有標記物，常用的標記物有(但不限于)：地高辛、生物素、熒光素等。

第二步：細胞破碎和胞內RNA的釋放：本發明采用超聲破碎法。由于在細胞破碎的過程中，會引起內源RNA酶的釋放，需要抑制這些酶的活性，同時又不能引起后續S1酶活性的喪失。故在裂解雜交液中加入了甲酰胺，用于變性RNA酶，同時在裂解液中還加入了酵母tRNA，雙重保護目標RNA不被降解。

本發明使用的裂解雜交液，其組成成分是80％甲酰胺(體積比)，400mM的NaCl(氯化鈉)，5mM的Na₂EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，1％的SDS(十二烷基磺酸鈉)以及0.5％的酵母tRNA。加入的甲酰胺能使RNA酶失活，加入的酵母tRNA能進一步保護目標RNA不被降解，加入的Na₂EDTA能結合體系中的重金屬離子，加入的NaCl和SDS有利于信號探針與目標RNA的雜交。

所述的裂解雜交液是指菌體超聲破碎和信號探針與目標RNA雜交的溶液環境。

第三步：信號探針與目標RNA雜交：取超聲破碎后的裂解雜交液，加入信號探針，變性后雜交。

所述變性后雜交，是指在94℃變性5min后雜交。

第四步：S1酶消化多余探針：雜交完成后，加入S1酶消化液。由于雜交的環境不適合S1酶消化，需要對S1酶消化液進行優化，使得S1酶消化液加入體系后，溶液體系適合S1酶的消化。由于S1酶切割單鏈核酸的特性，S1酶能將體系中的游離信號探針、RNA以及RNA/信號探針雜交體的單鏈部分切割，剩下與目標RNA完全雜交的目標RNA/信號探針雜交體。

所述的S1酶消化液，是指含有S1酶的，加入到雜交后的溶液中消化游離信號探針、RNA以及RNA/信號探針雜交體的單鏈部分，是本發明的關鍵。優化后的S1酶消化液組成如下：2U/μl的S1酶，25mM的ZnSO₄，50mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH4.2。