[發明專利]D-氨甲酰水解酶的突變體及其應用

有效

• 申請號: 200810035067.3
• 申請日: 2008-03-25
• 公開（公告）號: CN101544969A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發明（設計）人: 楊晟;余宏;李鍵;張大龍;姜衛紅;楊蘊劉
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 繆利明

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體內容涉及D-氨甲酰水解酶的突變體及其在生產D-對 羥基苯甘氨酸中的應用。

背景技術

D-對羥基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine，DHPG)是合成羥氨芐青霉素和羥氨芐 頭孢霉素等β-半合成內酰胺類抗生素的關鍵手性中間體。目前的全球市場需求在22000噸 左右，折合人民幣約17億元。以有機合成消旋對羥基苯甘氨酸再手性拆分曾是生產DHPG 的主要方法，80年代以后D-海因酶(D-hydantoinase，Dhase)/D-氨甲酰水解酶 (D-carbamoylase，Dcase)兩步不對稱水解混旋對羥基苯海因生產DHPG的方法逐漸為國 外大公司所采用，其原理如下：

酶法的技術原理是：用D-乙內酰脲酶(也稱為D-海因酶)將DL-對羥基苯海因不對 稱水解成N-氨甲酰基D-對羥基苯甘氨酸，然后在N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶(也稱為D- 氨甲酰水解酶，簡稱Dcase)的作用下，將N-氨甲酰基-D-對羥基苯甘氨酸不可逆水解轉 變成DHPG。

兩種酶中，DCase的熱穩定性相對較差，這對于只使用一次的全細胞轉化影響不太大， 但對于固定化酶的使用方式卻相當不利，不能被長時間反復使用。因此，提高DCase熱穩 定性是固定化酶的研發重點。

獲得熱穩定的酶，一種方法是從自然界篩選天然耐熱的酶，日本鐘淵株式會社從土壤 中篩選到一株能產生耐熱DCase的Pseudomonas?sp.KNK003(Ikenaka，Y.，et?al.，Bioscience Biotechnology?and?Biochemistry，1998.62(5)：p.882-886.)，但是與來源于Agrobacterium?sp. KNK712的不耐熱DCase相比，其比活力要低很多。

因此，鐘淵株式會社選擇了另一種獲得耐熱酶的方法，對來源于KNK712的DCase 基因進行隨機突變，隨后通過篩選大量突變體。鐘淵株式會社首先以羥胺對來源于 KNK712的DCase基因進行正鏈隨機突變，篩選27,000株突變體庫獲得熱穩定性提高約 5℃的突變酶，測序結果顯示57位的組氨酸突變為酪氨酸；隨后，鐘淵又對KNK712來 源的DCase基因片段的正鏈用亞硝酸鈉處理，而負鏈用羥胺處理后分別獲得突變體庫，篩 選得到耐熱突變體，測序結果顯示203位的脯氨酸突變為亮氨酸或絲氨酸可提高KNK712 DCase的熱穩定性，236位的纈氨酸突變為丙氨酸可提高熱穩定性10℃。進一步對上述3 個位點進行定點突變發現：57位的組氨酸變為亮氨酸；203位的脯氨酸突變為天冬酰胺， 谷氨酸，丙氨酸，異亮氨酸，組氨酸或蘇氨酸；236位的纈氨酸突變為蘇氨酸或絲氨酸后， 酶的熱穩定性均可提高。三突變酶455M(H57Y、P203E、V236A)的熱穩定性比野生型 酶提高了19℃，這些突變點申請了專利(池中康裕，et?al.，Editor.1993)(注：鐘淵對氨基 酸序列的編號與其他文獻不同，不計入第一位的甲硫氨酸，因此這3個突變點對應后面的 58，204和237位氨基酸殘基)。Giuliano等將來源于Agrobacterium?tumefaciens?NRRL B11291來源的DCase的243，250，279位的半胱氨酸殘基定點突變，發現243和279位 突變為丙氨酸后，酶穩定性可以提高6倍，這些突變申請了歐美日等國專利(Giuliano，G.， et?al.，1995，Eniricerche?Spa(Enie).p.677584-B1)。韓國Hak-Sung?Kim實驗室則通過DNA 混組技術，提高了來源于Agrobacterium?tumefaciens?NRRL?B11291的DCase的熱穩定性和 抗氧化能力。研究表明：四個點突變(Q23L、H58Y、M184L和T262A)導致酶的熱穩 定性和抗氧化性都增強，其中T262A表現出最強的影響力(Oh，K.H.，et?al.，Biotechnol?Prog， 2002.18(3)：p.413-7.；Oh，K.H.，et?al.，Protein?Eng，2002.15(8)：p.689-95.)。