[發(fā)明專利]提高脫氮假單胞桿菌維生素B12產(chǎn)量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810034948.3
• 申請(qǐng)日: 2008-03-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101538599A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張嗣良;趙強(qiáng);李昆太;劉東洪;莊英萍;儲(chǔ)炬;王振國(guó);李永亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué);河北華榮制藥有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/42
• 分類號(hào): C12P19/42;C12R1/38
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 范 征

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種利用利用脫氮假單 胞桿菌高產(chǎn)維生素B₁₂的新方法。

背景技術(shù)

維生素B₁₂(VB₁₂)通常用來(lái)表示鈷胺素類化合物，它是一種重要的生物活性 物質(zhì)，可以用來(lái)治療惡性貧血癥，同時(shí)也是許多微生物和動(dòng)物的生長(zhǎng)因子。自 然界中，維生素B₁₂的生物合成存在兩種不同的途徑，即好氧途徑和厭氧途徑， 但是VB₁₂的生物合成嚴(yán)格局限于一些微生物中，目前用于商業(yè)化生產(chǎn)VB₁₂的微 生物主要有謝氏丙酸桿菌(Propionibacterium?shermanii)、菲氏丙酸桿菌(P. freudenreichii)和脫氮假單胞桿菌(Pseudomonas?denitrificans)等。脫氮假單胞桿 菌好氧合成維生素B₁₂的途徑已經(jīng)詳細(xì)闡明[Warren?M?J等，The?biosynthesis?of adenosylcobalamin(vitamin?B₁₂)[J].Nat.Prod.Rep，2002，19：390-412]。正是由于對(duì) 維生素B₁₂合成途徑的了解，所以可以借助誘變和分子生物學(xué)等手段來(lái)改造菌 株，使得脫氮假單胞桿菌菌株的維生素B₁₂生產(chǎn)能力大大提高。由于維生素B₁₂產(chǎn)率高，目前在工業(yè)生產(chǎn)中幾乎都是使用脫氮假單胞桿菌來(lái)作為好氧生產(chǎn)維生 素B₁₂的工業(yè)菌株。

脫氮假單胞桿菌好氧合成維生素B₁₂的過(guò)程一共需要8步甲基化[Battersby A?R，Leeper?F?J.Biosynthesis?of?Vitamin?B₁₂[J].Topics?in?Current?Chemistry，1998，195： 143-193]。甜菜堿(三甲基甘氨酸)的每個(gè)分子含有三個(gè)甲基，它可作為生物合成 維生素B₁₂的甲基供體。已有報(bào)道指出在脫氮假單胞桿菌中，甜菜堿-高半胱氨 酸轉(zhuǎn)甲基酶對(duì)維生素B₁₂的大量合成有作用。甜菜堿-高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶催化 甜菜堿向高半胱氨酸轉(zhuǎn)移一個(gè)甲基，分別形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸，因此 甜菜堿在參與維生素B₁₂生物合成過(guò)程中的甲基化反應(yīng)具有較為重要的作用。也 有研究表明，甜菜堿對(duì)脫氮假單胞桿菌中VB₁₂的合成和卟啉的過(guò)量生成起著較 為重要的作用。另外，甜菜堿是一種良好的滲透壓調(diào)節(jié)劑，有報(bào)道甜菜堿和膽 堿能促進(jìn)細(xì)胞表面對(duì)代謝產(chǎn)物的分泌，從而對(duì)細(xì)菌產(chǎn)維生素B₁₂具有刺激效果。

盡管本領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甜菜堿在維生素B₁₂生物合成過(guò)程中具有非常重要的 作用。然而，在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)于甜菜堿所引起的脫氮假單胞桿菌代謝變 化情況目前沒(méi)有系統(tǒng)的研究，也沒(méi)有系統(tǒng)地研究過(guò)在脫氮假單胞桿菌大規(guī)模發(fā) 酵生產(chǎn)過(guò)程中甜菜堿的較佳且較經(jīng)濟(jì)的控制策略。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用脫氮假單胞桿菌高產(chǎn)維生素B₁₂的方法，該 方法主要是通過(guò)調(diào)節(jié)甜菜堿在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種利用脫氮假單胞桿菌生產(chǎn)維生素B₁₂的方 法，所述方法包括：

(1)調(diào)節(jié)初始的脫氮假單胞桿菌培養(yǎng)基中甜菜堿濃度為10-20g/L，培養(yǎng)脫 氮假單胞桿菌，從而產(chǎn)生維生素B₁₂；和

(2)當(dāng)培養(yǎng)基中甜菜堿的濃度降低到3-7g/L時(shí)，補(bǔ)充加入甜菜堿，并維持 培養(yǎng)基中甜菜堿濃度為3-7g/L至發(fā)酵結(jié)束。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)中，調(diào)節(jié)初始的脫氮假單胞桿菌培養(yǎng)基中甜菜 堿濃度為12-18g/L；更佳的為13-17g/L；最佳的為14-16g/L，如15g/L。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，當(dāng)培養(yǎng)基中甜菜堿的濃度降低到5-7g/L時(shí)， 補(bǔ)充加入甜菜堿。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，維持培養(yǎng)基中甜菜堿濃度為5-7g/L。