[發明專利]一種利用整合子系統定點、定向的基因重組方法

無效

• 申請號: 200810034791.4
• 申請日: 2008-03-18
• 公開（公告）號: CN101280301A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 呂元;楊澤華;關明;魏取好;陳楠
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/11;C12N15/70;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及一種基因重組的方法，具體涉及一種利用整合子系統將目的基因定點且定向地進行基因重組的方法。

背景技術

已知在生物技術研究中，將目的基因插入到染色體基因組DNA，可以采用同源重組的辦法或使用轉座子的方法，但實踐表明，同源重組的效率較低，操作麻煩，并且由于目的基因的插入而使原有基因遭受破壞；使用轉座子的方法，也存在插入到染色體的部位是隨機的，而且操作使用的轉座酶價格昂貴等缺陷。

整合子由于其與細菌的多重耐藥性有關而得到廣泛的關注。近年來在非臨床菌株中發現有整合子的存在，其分布范圍要比預期廣得多。目前，本領域的有關學者主張將整合子作為細菌基因進化的有力工具。通常，一個整合子至少包括三個最基本的元件：編碼屬于酪氨酸重組酶家族的整合酶的基因，位于整合酶編碼區而與整合酶編碼方向相反的驅動下游基因盒表達的啟動子Pc，整合酶所識別的重組位點attI?；蚝杏梢粋€通常無啟動子的開放讀碼框和3′端整合酶重組識別位點attC構成。整合酶通常催化三種類型的重組反應：attI×attI、attI×attC、attC×attC，其中attI×attC之間的重組效率比另外兩種高得多，在此，由于attC序列具有一定的方向性，因而使得整合到attI位點的基因盒與Pc啟動子方向一致而使其相應的基因得到有效的表達。研究表明，數個基因盒可以同時存在于一個整合子中，其相應基因的表達水平通常與其在整合子中的位置有關。距離Pc啟動子越近的基因盒其表達水平越高，因此插入到attI位點的基因盒表達水平最高。

發明內容

本發明目的是提供一種簡便、快速的基因重組的方法，具體涉及一種利用整合子系統將目的基因定點且定向地進行基因重組方法，尤其涉及一種利用整合子系統將目的基因定點且定向地插入到大腸桿菌染色體的基因重組方法。

本發明利用含有目的DNA片段的基因盒插入到整合子的attI位點時表達水平增高的原理，對陽性克隆進行篩選。本方法采用整合子系統作為工具，首先構建在多克隆位點兩側含有attC序列的工具載體，然后將目的基因克隆到該載體，目的基因在宿主菌表達整合酶的情況下，能夠定點且定向地插入到大腸桿菌基因組DNA中的attI位點。

實踐證明，本方法簡便易行，只需常規簡單的基因克隆操作，僅需要4天時間就可以將目的基因插入到宿主菌的染色體DNA中。所述的整合子系統作為分子生物學工具具有良好的應用前景，例如可用于獲取含有目的基因的大片段DNA；同時，目的基因插入到宿主染色體定點且定向的特性，在基因治療中將有助于解決目的基因插入到基因組DNA的靶向性問題等。

本發明通過下述技術方案和方法實現：

1、通過PCR擴增獲取目的基因；

2、通過下述步驟制備工具載體：

構建工具載體pACZC，其特征是在來源于pUC19質粒(TaKaRa)的LacZ基因的兩側引入整合酶識別重組序列attC，將該片段克隆到pACYC184質粒(J?Bacteriol，1978，134：1141-1156.)，該重組質粒命名為pACZC，利用其上LacZ上的多克隆位點，將任意DNA片段裝配成基因盒結構。在上述pACZC質粒的LacZ編碼區加入篩選標志基因aadA2，其編碼對鏈霉素的抗性，該重組質粒命名為pACAZC。

3、定點、定向地將目的基因插入到大腸桿菌的染色體中

將高表達整合酶的質粒pUCINT(中華檢驗醫學雜志，2007，30：1398-1400)轉化菌株DHS(專利申請號：200810033538.7)，在該株細菌的染色體DNA的已知位點含有整合酶識別重組序列attI，轉化后的細菌命名為DHS1；將目的基因克隆到工具載體pACAZC的多克隆位點，轉化DHS1菌株，利用整合酶催化高效率的attC位點和位點attI位點之間的重組反應，以及其對attC位點識別的方向性，實現目的基因定點且定向地插入到DHS1菌株染色體DNA的attI位點。利用篩選標志基因aadA2插入到attI位點時獲得整合子的固有啟動子Pc而高效表達，在含有鏈霉素的LB瓊脂平板中篩選得到陽性克隆。為消除aadA2基因背景表達造成的假陽性克隆，使用PCR技術對篩選到的陽性克隆作進一步的鑒定。

采用本發明建立的方法及配套工具載體，在不使用特殊設備和試劑的情況下，僅用4天時間就可以把目的基因定點且定向地插入到大腸桿菌染色體。本方法簡便、快速、成本低廉，可應用于分子生物學技術。

附圖說明

圖1是目的基因插入到DHS1菌株基因組DNA的流程圖，