[發明專利]一種血清中氯霉素殘留量的液相色譜-串聯質譜測定方法

無效

• 申請號: 200810034203.7
• 申請日: 2008-03-04
• 公開（公告）號: CN101526506A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發明（設計）人: 王磊
• 申請（專利權）人: 王磊
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/34;G01N30/60;G01N30/08;G01N30/50;G01N30/72
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技術領域

本發明涉及一種對生物體內氯霉素殘留的測定方法，更具體是對人及動物血清中殘留的微量氯霉素進行定量測定的方法。

背景技術

氯霉素是一種相對廉價且較有效的廣譜抗生素，主要通過阻礙細菌70S核糖體與50S亞基的結合，干擾細菌蛋白質合成而產生抑菌作用。在其使用的50多年中曾有效的用于人類以及動物的多種感染性疾病的治療，但是多年的臨床應用表明，氯霉素對人類具有較大的毒副作用，其作用是結構中與羰基相連的一CHCl2基團引起的，它能使人體產生不可逆性骨髓造血功能障礙性疾病-再生障礙性貧血和粒細胞缺乏癥，還可以導致死亡率極高的“灰嬰綜合癥”。

氯霉素的口服劑，針劑等藥品已經在臨床上很少使用，近乎消失。由于氯霉素的化學性質極為穩定，在曾經用藥的食用性動物組織中很容易產生藥物殘留。世界許多國家都禁止在食用性動物飼養和治療中使用氯霉素，即食用性動物組織和動物源食品中CAP的殘留量為不得檢出。雖然我國早已禁止CAP做為獸藥使用，但是由于CAP對水產動物病原菌的抑菌作用強、價格便宜，20世紀80～90年代曾廣泛地應于水產、畜牧、禽類等養殖中各種細菌病的預防與治療上。由于各地對CAP的危害認識不一和藥物使用慣性等原因，確實存在養殖戶濫用抗生素的情況。有資料顯示近幾年各地分別有氯霉素檢出的陽性報道，所以食源性氯霉素蓄積引發血液病逐漸得到認識。

再生障礙性貧血及粒細胞缺乏癥是危害人民生活健康的一類常見血液病，而且近年發病率有不斷增高趨勢。所以對于此類血液病患者及有危險因素接觸史的“亞健康”人群進行氯霉素微量殘留的檢測，對于疾病的預防和治療都有重要意義。由于血清中小分子物質豐富，且氯霉素殘留非常微量，所以血清中氯霉素的檢測方法一直是難題。

血清中殘留氯霉素的檢測分別可采用微生物法、免疫法、放免法、GC、HPLC、GC-MS等分析方法，但方法檢測的靈敏度大多難以滿足取樣量少、準確及高靈敏度的要求，近年來，隨著色譜技術的飛速發展，對血清中氯霉素殘留進行高靈敏度的定量分析成為可能。

現行的氯霉素殘留的色譜-串連質譜檢測中，或采用外標法定量，或用未經提取的氯霉素標樣作為定量標準，影響檢測結果的可靠性。同時，因其樣品預處理采用多次液-液萃取、固相萃取或液-液萃取與固相萃取相結合的方法，其操作煩瑣費，并易引入污染，而氯霉素的色譜分離又需要一定的時間，故難以滿足實際工作尤其是大量分批檢測分析的需要。

發明內容

本發明的目的是建立一種可快速、同時有效地對血清中氯霉素進行定量測定地切實可行地并具有通用性地方法，可較好地滿足實際工作的需要。

本發明是這樣實現的：

本發明建立的HPLC-MS方法以氘代氯霉素為內標，以內標法對血清中殘留的氯霉素進行定量。與外標法相比，利用理化性質與氯霉素十分相似的氘代氯霉素為內標，可對包括樣品預處理、色譜分離和質譜檢測在內的樣品分析全過程中所可能產生的各種誤差進行校正。

本發明的定量工作曲線，系在空白血清中添加氯霉素標樣后提取獲得，可避免因提取回收率不同而產生的影響。在樣品預處理中，采用簡便的一次液-液萃取法對血清中氯霉素進行凈化和富集，在樣品的色譜分離中，采用細口徑的色譜短柱和等度或梯度洗脫法實現氯霉素的快速色譜分離。

1.樣品處理方法：

液-液萃取法：取適量血清入離心管，添加相當于待測血清體積0.1-5倍量的有機溶劑(甲醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚或乙醚)后漩渦混合提取，離心分離后，取上清液，經0.45μm濾膜過濾后待測，棄殘渣。

2.HPLC-MS測定條件：

液相條件：流動相由乙腈(或甲醇)和含甲酸或乙酸(0.01～0.5％V/V)水溶液或醋酸銨(1-100mmol)的水溶液(用氨水調節PH＝6-9)組成，采用等度或梯度洗脫；乙腈：1-100mmol醋酸銨水溶液用氨水調節PH＝6-9，以體積比記為80-20％，20-80％。色譜柱硅膠鍵合相填料柱(C18、C8或氰基)的細徑短柱(內徑為1.0-3.0mm；長度為30-100mm)。

質譜條件：采用電噴霧離子源，負離子多反應監測掃描。離子選擇通道為Q1/Q3?m/z分別為氯霉素：321/151或/和321/176或/和321/257；內標為氘代氯霉素：326/156或/和326/179或/和326/262。

3.標準工作曲線的制備和樣品中氯霉素的定量