[發(fā)明專利]一種血清中氯霉素殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810034203.7
• 申請日: 2008-03-04
• 公開（公告）號: CN101526506A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王磊
• 申請（專利權(quán)）人: 王磊
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/34;G01N30/60;G01N30/08;G01N30/50;G01N30/72
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種對生物體內(nèi)氯霉素殘留的測定方法，更具體是對人及動物血清中殘留的微量氯霉素進(jìn)行定量測定的方法。

背景技術(shù)

氯霉素是一種相對廉價且較有效的廣譜抗生素，主要通過阻礙細(xì)菌70S核糖體與50S亞基的結(jié)合，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成而產(chǎn)生抑菌作用。在其使用的50多年中曾有效的用于人類以及動物的多種感染性疾病的治療，但是多年的臨床應(yīng)用表明，氯霉素對人類具有較大的毒副作用，其作用是結(jié)構(gòu)中與羰基相連的一CHCl2基團(tuán)引起的，它能使人體產(chǎn)生不可逆性骨髓造血功能障礙性疾病-再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥，還可以導(dǎo)致死亡率極高的“灰嬰綜合癥”。

氯霉素的口服劑，針劑等藥品已經(jīng)在臨床上很少使用，近乎消失。由于氯霉素的化學(xué)性質(zhì)極為穩(wěn)定，在曾經(jīng)用藥的食用性動物組織中很容易產(chǎn)生藥物殘留。世界許多國家都禁止在食用性動物飼養(yǎng)和治療中使用氯霉素，即食用性動物組織和動物源食品中CAP的殘留量為不得檢出。雖然我國早已禁止CAP做為獸藥使用，但是由于CAP對水產(chǎn)動物病原菌的抑菌作用強(qiáng)、價格便宜，20世紀(jì)80～90年代曾廣泛地應(yīng)于水產(chǎn)、畜牧、禽類等養(yǎng)殖中各種細(xì)菌病的預(yù)防與治療上。由于各地對CAP的危害認(rèn)識不一和藥物使用慣性等原因，確實存在養(yǎng)殖戶濫用抗生素的情況。有資料顯示近幾年各地分別有氯霉素檢出的陽性報道，所以食源性氯霉素蓄積引發(fā)血液病逐漸得到認(rèn)識。

再生障礙性貧血及粒細(xì)胞缺乏癥是危害人民生活健康的一類常見血液病，而且近年發(fā)病率有不斷增高趨勢。所以對于此類血液病患者及有危險因素接觸史的“亞健康”人群進(jìn)行氯霉素微量殘留的檢測，對于疾病的預(yù)防和治療都有重要意義。由于血清中小分子物質(zhì)豐富，且氯霉素殘留非常微量，所以血清中氯霉素的檢測方法一直是難題。

血清中殘留氯霉素的檢測分別可采用微生物法、免疫法、放免法、GC、HPLC、GC-MS等分析方法，但方法檢測的靈敏度大多難以滿足取樣量少、準(zhǔn)確及高靈敏度的要求，近年來，隨著色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，對血清中氯霉素殘留進(jìn)行高靈敏度的定量分析成為可能。

現(xiàn)行的氯霉素殘留的色譜-串連質(zhì)譜檢測中，或采用外標(biāo)法定量，或用未經(jīng)提取的氯霉素標(biāo)樣作為定量標(biāo)準(zhǔn)，影響檢測結(jié)果的可靠性。同時，因其樣品預(yù)處理采用多次液-液萃取、固相萃取或液-液萃取與固相萃取相結(jié)合的方法，其操作煩瑣費，并易引入污染，而氯霉素的色譜分離又需要一定的時間，故難以滿足實際工作尤其是大量分批檢測分析的需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是建立一種可快速、同時有效地對血清中氯霉素進(jìn)行定量測定地切實可行地并具有通用性地方法，可較好地滿足實際工作的需要。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

本發(fā)明建立的HPLC-MS方法以氘代氯霉素為內(nèi)標(biāo)，以內(nèi)標(biāo)法對血清中殘留的氯霉素進(jìn)行定量。與外標(biāo)法相比，利用理化性質(zhì)與氯霉素十分相似的氘代氯霉素為內(nèi)標(biāo)，可對包括樣品預(yù)處理、色譜分離和質(zhì)譜檢測在內(nèi)的樣品分析全過程中所可能產(chǎn)生的各種誤差進(jìn)行校正。

本發(fā)明的定量工作曲線，系在空白血清中添加氯霉素標(biāo)樣后提取獲得，可避免因提取回收率不同而產(chǎn)生的影響。在樣品預(yù)處理中，采用簡便的一次液-液萃取法對血清中氯霉素進(jìn)行凈化和富集，在樣品的色譜分離中，采用細(xì)口徑的色譜短柱和等度或梯度洗脫法實現(xiàn)氯霉素的快速色譜分離。

1.樣品處理方法：

液-液萃取法：取適量血清入離心管，添加相當(dāng)于待測血清體積0.1-5倍量的有機(jī)溶劑(甲醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、乙腈、特丁基甲醚或乙醚)后漩渦混合提取，離心分離后，取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后待測，棄殘渣。

2.HPLC-MS測定條件：

液相條件：流動相由乙腈(或甲醇)和含甲酸或乙酸(0.01～0.5％V/V)水溶液或醋酸銨(1-100mmol)的水溶液(用氨水調(diào)節(jié)PH＝6-9)組成，采用等度或梯度洗脫；乙腈：1-100mmol醋酸銨水溶液用氨水調(diào)節(jié)PH＝6-9，以體積比記為80-20％，20-80％。色譜柱硅膠鍵合相填料柱(C18、C8或氰基)的細(xì)徑短柱(內(nèi)徑為1.0-3.0mm；長度為30-100mm)。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測掃描。離子選擇通道為Q1/Q3?m/z分別為氯霉素：321/151或/和321/176或/和321/257；內(nèi)標(biāo)為氘代氯霉素：326/156或/和326/179或/和326/262。

3.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備和樣品中氯霉素的定量