[發明專利]抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的制備及應用方法

無效

• 申請號: 200810033988.6
• 申請日: 2008-02-28
• 公開（公告）號: CN101235088A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 崔大祥;韓月東;武國軍;高峰;賀蓉
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K17/06;C12N15/13;C12N15/70;G01N33/53;A61K49/16;A61K47/42;A61P35/00
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種生物工程技術領域的方法，具體是一種帶有跨膜肽KTAT的抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的制備及應用方法。

背景技術

人γ-精漿蛋白是前列腺癌分泌的特異性抗原，存在于前列腺癌細胞與其轉移的癌細胞中，是前列腺癌的特異性標志物。應用碘元素¹³¹標記的抗人精漿蛋白單克隆抗體進行前列腺癌的放射性免疫顯像，具有較高的靈敏度和特異性，優于B型超聲波與計算機控制的斷層掃描檢查。但由于鼠源性抗體在人體內應用會導致人抗鼠抗體的產生，因此限制了其臨床應用。針對目前的技術不足，制備的單鏈抗體因其能較好地保持對抗原的親和性，分子量小，穿透力強，抗原性弱，體內應用時，具有許多親本抗體不具備的優點，且易與納米粒子如磁性納米粒子、量子點等的聯接，構建成多種新功能納米探針，在前列腺癌抗原的血清學檢測，核磁共振與熒光分子成像，隨帶藥物靶向定位方面具有應用前景。

經對現有技術的文獻檢索發現，“Biotechnology?Progress”(生物技術的進展)2006年22卷第11期1084-1089頁上發表的“Expression?of?single-chain?Fvgene?specific?for?γ-seminoprotein?by?RTS?and?its?biological?activityidentification”(利用快速翻譯系統制備抗γ-精漿蛋白單鏈抗體與抗體生物活性鑒定)文章外，未見其它相關報道。在此文章中，我們通過聚合酶鏈反應技術，獲取了人γ-精漿蛋白單鏈抗體的基因片段，然后采用快速翻譯系統試劑盒，制備出了人γ-精漿蛋白單鏈抗體，并通過前列腺癌細胞抗體熒光染色分析，與抗原抗體結合免疫沉淀方法證明制備的人γ-精漿蛋白單鏈抗體具有生物活性。我們報道的這種方法，其優勢就是在短時間內，能夠獲得大量抗體，費用低，可以供研究與檢測試劑開發用。但是，此單鏈抗體跨膜效率與結合效率仍未達到最佳水平。本發明針對其不足，在跨膜肽中增加了一個耐氨酸，增加了單鏈抗體所隨帶的正電荷，增強了與納米粒子結合效率與跨越細胞膜效率。

發明內容

本發明的目的在于針對傳統前列腺癌抗體制備周期長、抗體分子量大且不易穿越癌細胞膜的不足，提供一種帶有跨膜肽的抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的制備及應用方法。本發明通過引物設計與聚合酶鏈反應技術，獲得了抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體基因片段，并采用快速翻譯系統技術，制備出具有高生物活性的帶有跨膜肽KTAT的抗人γ精漿蛋白單鏈抗體。把抗人γ精漿蛋白單鏈抗體與磁性納米粒子連接，制備成抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體包被的磁性納米粒子復合探針；把抗人γ精漿蛋白單鏈抗體與量子點連接，制備成抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體包被的量子點復合探針，制備的納米探針可以應用于血清學檢測、分子顯像方面等。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明所涉及的抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的制備方法，包括以下步驟：

第一步，設計引物，采用聚合酶鏈反應技術獲取抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體基因片段

為使制備的抗體更易純化和穿透細胞膜，引物設計為在氨基末端帶有組氨酸尾巴和跨膜肽KTAT(耐氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-蘇氨酸)。上游引物為：5’-CGCTTAATTAAA?CAG?ACC?AAG?GCG?ACC?CAT?ATG?ACC?CAG?GTC?CAA?CTG?CAG-3’，下游引物為：5’-TTAGTTAGTTACCGGATCCC?ACG?TTT?GAT?CTC?CAG-3’，總長度786bp(堿基對)。

應用聚合酶鏈反應(PCR)1獲取特異性基因片段：10×PCR緩沖液3μl，2.5mmol/L堿磷酸脫氧核苷酸3μl，上游引物1μl(10pmol)，下游引物1μl，E4B7ScFv基因質粒模板2μl，25mmol/L?MgCl₂?3μl，Taq酶1μl(2U)。將滅菌去離子水定容到30μl。聚合酶鏈反應1條件為：94℃2min，然后94℃1min，55℃1min，72℃1min，共25個循環，最后72℃7min，產物作為PCR反應2模板。

應用聚合酶鏈反應(PCR)2獲取足夠量的線性特異性基因片段：