[發明專利]抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的制備及應用方法

無效

• 申請號: 200810033988.6
• 申請日: 2008-02-28
• 公開（公告）號: CN101235088A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 崔大祥;韓月東;武國軍;高峰;賀蓉
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K17/06;C12N15/13;C12N15/70;G01N33/53;A61K49/16;A61K47/42;A61P35/00
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1、一種抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

第一步，設計引物，采用聚合酶鏈技術獲取抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體基因片段：引物設計為在氨基末端帶有組氨酸尾巴和跨膜肽蘇氨酸-丙氨酸-蘇氨酸，上游引物為：5’-CGCTTAATTAAA?AAG?CAG?ACC?GCG?ACC?CAT?ATG?ACC?CAG?GTC?CAACTG?CAG-3’，下游引物為：5’-TTAGTTAGTTACCGGATCCC?ACG?TTT?GAT?CTC?CAG-3’，總長度783bp，然后應用聚合酶鏈反應獲取抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體基因片段；

第二步，使用抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體基因片段作模板制備抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體。

2、根據權利要求1所述的抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的制備方法，其特征是，所述應用聚合酶鏈反應獲取抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體基因片段，包含兩步聚合酶鏈反應：

第-步，應用聚合酶鏈反應1獲取特異性基因片段：10×PCR緩沖液3μl，2.5mmol/L堿磷酸脫氧核苷酸3μl，上游引物1μl，下游引物1μl，E4B7ScFv基因質粒模板2μl，25mmol/L氯化鎂3μl，Taq聚合酶1μl，將滅菌去離子水定容到30μl；聚合酶鏈反應1條件為：94℃2分鐘，然后94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共25個循環，最后72℃7分鐘，產物作為聚合酶鏈反應2模板；

第二步，應用聚合酶鏈反應2獲取足夠量的線性特異性基因片段：

上游引物：5’-CGCTTAATTAAA?AAG?CAG?ACC?GCG-3’，下游引物：5’-TTAGTTAGTTACCGGATCCC-3’，10×PCR緩沖液5μl，2.5mmol/L堿磷酸脫氧核苷酸5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，PCR反應1產物模板5μl，25mmol/L氯化鎂5μl，Taq聚合酶1μl，將滅菌去離子水定容到50μl；聚合酶鏈反應2條件為：94℃4分鐘，然后94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共25個循環，最后72℃10分鐘，獲得的線性抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體基因片段作為下一步反應的模板。

3、根據權利要求1所述的抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的制備方法，其特征是，所述使用抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體基因片段作模板制備抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體，具體為：大腸桿菌提取物12μl，反應緩沖液10μl，氨基酸溶液12μl，蛋氨酸1μl，重構緩沖液5μl，模板10μl，總體積50μl，反應條件：30℃6小時，獲得產物通過包被有抗組氨酸抗體的鎳柱快速純化。

4、一種應用抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的方法，其特征在于，將抗人γ-精漿蛋白單鏈抗體與磁性納米粒子連接，包括以下步驟：

(1)制備樹形分子包裹的磁性納米粒子

采用常規共沉淀法制備磁性納米粒子，用胺基硅烷對磁性粒子的表面進行修飾后，獲得伯胺基表面的磁性納米粒子，伯胺基表面的磁性納米粒子與酯基端的樹形分子進行共價結合，形成樹形分子包裹的磁性納米粒子；

(2)將樹形分子包裹的磁性納米粒子與單鏈抗體連接成復合物

在戊二醛作用下，樹形分子修飾的磁性納米粒子與抗人γ精漿蛋白單鏈抗體混合，混合條件是：1ml?0.85mg/ml單鏈抗體與1ml?2.5mg/ml樹形分子修飾的磁性納米粒子直接混合，在4℃反應10小時，然后，加入氨基乙醇，在25℃攪動反應2小時，利用磁鐵，分離出單鏈抗體包被的磁性納米粒子，在4℃保存備用。

5、根據權利要求4所述的應用抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的方法，其特征是，所述的單鏈抗體包被的磁性納米粒子，結合酶聯免疫反應，用于建立起檢測血清中精漿蛋白含量的酶聯免疫試劑盒；或結合蛋白芯片技術，用于建立起檢測血清中精漿蛋白含量的蛋白芯片。

6、根據權利要求4所述的應用抗人精漿蛋白特異性單鏈抗體的方法，其特征是，所述的單鏈抗體包被的磁性納米粒子，與核磁共振結合起來，作為造影劑，用于前列腺癌原位灶與轉移灶的分子顯像；或與治療藥物連接，隨帶治療藥物直接進入前列腺癌細胞中，或在體外施加磁場，增強前列腺癌治療效果。