[發(fā)明專利]食源性致病菌分子檢測(cè)標(biāo)記的建立方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810032391.X
• 申請(qǐng)日: 2008-01-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101343662A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉戰(zhàn)民;尹京苑
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海上大專利事務(wù)所（普通合伙）
• 代理人: 何文欣

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種食源性致病菌分子檢測(cè)標(biāo)記的建立方法。

技術(shù)背景

食源性致病菌是引起食物中毒，危害人類健康的重要微生物，無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，都是影響食品安全的最主要原因，其中金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特、沙門氏桿菌和副溶血弧菌等是國(guó)際公認(rèn)的危害廣泛的四大致病微生物。近年來(lái)全球多個(gè)國(guó)家多次爆發(fā)由上述致病菌引起的食源性疾病。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起人類感染和細(xì)菌性食物中毒的一種重要致病菌，由它引起的食物中毒發(fā)生頻率極高。在我國(guó)由金黃色葡萄球菌引起的中毒病例占食物中毒總數(shù)的20％～25％，是僅次于沙門氏菌和副溶血性弧菌的第三大致病菌。據(jù)國(guó)外疾病控制中心報(bào)道，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒居第二位，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33％，加拿大則高達(dá)45％。據(jù)報(bào)道，我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中70％～80％是由沙門氏菌引起的。

目前，食源性病原微生物快速檢測(cè)的方法是基于核酸的分子生物學(xué)的方法，主要有核酸探針?lè)ê途酆厦告湻磻?yīng)(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)法。PCR檢測(cè)方法存在著檢測(cè)準(zhǔn)確性高(10⁵cfu/mL)和檢測(cè)時(shí)間短(8h)等優(yōu)勢(shì)，其準(zhǔn)確度主要取決于使用的檢測(cè)標(biāo)記的特異性。目前已報(bào)道的食源性致病菌分子檢測(cè)標(biāo)記有幾十多種，這包括金黃色葡萄球菌腸毒素基因(entA、entB、entC1、entD和entE)、耐熱核酸酶基因(nuc)、表皮剝脫毒素(eta和etb)基因和中毒性休克綜合癥毒素基因(tst)、耐甲氧西林基因(mecA和femA)、16S-23S?rRNA、沙門氏菌的invA、invB、invC、invD、invE、hilA、fimA、rfb、agfA、viaB、SPV、單核增生李斯特菌的hlyA、iap、inlA、inlB、prfA、plcA、plcB、mpl、志賀氏菌的ial和virA、副溶血性弧菌的tdh、trh和腸出血性大腸埃希氏菌的hly、slt、eae基因等。但是越來(lái)越多的研究表明，現(xiàn)有的致病菌的檢測(cè)標(biāo)記都是通過(guò)比較繁瑣和較長(zhǎng)時(shí)間的研究工作而獲得的，其數(shù)量少、特異性低，而且利用已有的分子檢測(cè)標(biāo)記建立的檢測(cè)方法在實(shí)際檢測(cè)出現(xiàn)了假陽(yáng)性和假陰性的錯(cuò)誤結(jié)果，這就要求人們建立一種新的分子檢測(cè)標(biāo)記的發(fā)掘方法，以便發(fā)掘特異性更高的分子檢測(cè)標(biāo)記，以解決食源性致病菌分子檢測(cè)方法的不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的食源性致病菌分子檢測(cè)標(biāo)記特異性不高、檢測(cè)方法存在誤檢等問(wèn)題而提供一種食源性致病菌分子檢測(cè)標(biāo)記的建立方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種食源性致病菌分子檢測(cè)標(biāo)記的建立方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

a.收集一種食源性致病菌的所有基因組序列；

b.選取步驟a中獲得的基因組序列中的任一基因組切分成長(zhǎng)度為500～1000bp的片段，將每個(gè)切分片段與其余的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，保留相似性達(dá)到98％以上的切分片段，得到保守序列片段；

c.將步驟b獲得的保守序列片段中的任一片段與其他微生物基因組序列進(jìn)行比對(duì)，剔除保守序列片段中與其他微生物基因組序列相同的片段，則保留下來(lái)的序列片段即為該食源性致病菌的特異性標(biāo)記群；

d.將步驟c獲得的特異性標(biāo)記群中的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行篩選，得到食源性致病菌分子檢測(cè)標(biāo)記。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法具有如下顯而易見(jiàn)的突出特點(diǎn)和顯著優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明首次提出了利用生物信息學(xué)和微生物基因組學(xué)相結(jié)合發(fā)掘食源性致病菌分子檢測(cè)標(biāo)記的方法。

2、本發(fā)明方法獲得的食源性致病菌分子檢測(cè)標(biāo)記的特異性比現(xiàn)有的分子檢測(cè)標(biāo)記的特異性要高。

3、本發(fā)明不需要進(jìn)行分子克隆、基因測(cè)序、PCR等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，可以節(jié)約財(cái)力。

4、本發(fā)明獲得的分子檢測(cè)標(biāo)記數(shù)量大，可以進(jìn)一步深入研究和利用。

5、本發(fā)明獲得分子檢測(cè)標(biāo)記能夠滿足生物芯片對(duì)檢測(cè)標(biāo)記的要求。

6、本發(fā)明方法同樣適合于其他微生物的分子檢測(cè)標(biāo)記的發(fā)掘。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明方法的實(shí)施例流程圖

具體實(shí)施方式

下面以金黃色葡萄球菌分子檢測(cè)標(biāo)記的建立方法為具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，本實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

實(shí)施例一具體步驟如下：