[發明專利]高致病性豬藍耳病病毒RT－PCR快速檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200810032141.6
• 申請日: 2008-08-25
• 公開（公告）號: CN101343670A
• 公開（公告）日: 2009-01-14
• 發明（設計）人: 何世成;范仲鑫;劉道新;談志祥;邱立新;魯杏華;唐小明;黃建龍
• 申請（專利權）人: 湖南省獸醫總站
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及獸醫生物技術領域的診斷技術，具體是一種檢測高致病性豬藍耳病病毒的診斷方法和專用試劑盒。

背景技術

豬藍耳病，也稱為豬繁殖與呼吸綜合征(porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，PRRS)是由豬藍耳病病毒(PRRSV)引起的一種豬的傳染病，其臨診特征為各種年齡的豬均可感染，病豬厭食、嗜睡、體溫升高，妊娠母豬發生早產、流產、死胎、弱胎和木乃伊胎，種公豬性功能下降，仔豬和育肥豬呼吸障礙。其特征性病理變化為間質性肺炎，皮膚發紺。1987年該病首次報道于美國，隨后迅速蔓延北美、歐洲及亞洲各國。在我國，郭寶清等于1996年從北京地區分離到了PRRSV，首次證實了PRRS在我國的存在，隨后許多省市也陸續報道了該病的發生。2006、2007年豬“高熱病”席卷了我國的大部分省區，給養豬業造成了巨大的經濟損失，其主要病原之一就是變異了的豬籃耳病病毒，也稱為高致病性豬藍耳病病毒。相較于其它PRRSV毒株，高致病性豬藍耳病病毒有更高的致病性，其能產生100％仔豬發病率和50％以上的死亡率。目前，檢測高致病性豬藍耳病病毒的主要方法有病毒分離、過氧化物酶單層試驗(IPMA)和RT-PCR診斷方法。病毒分離和過氧化物酶單層試驗技術要求較高，耗時長，操作復雜，很難在實驗室廣泛應用。由中國動物疫病預防控制中心研發的高致病性豬藍耳病病毒RT-PCR檢測試劑盒目前被廣泛應用于全國的臨床檢測實驗室，有穩定而權威的檢測準確性，但該試劑盒采用常規的核酸提取試劑，操作步驟多，容易造成提取過程中的RNA污染或降解，其兩步法RT-PCR檢測也給實驗帶來一定的污染風險，并延長了實驗時間。

發明內容

本發明根據Genbank上的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)變異株(高致病性豬藍耳病病毒)的核苷酸序列與古典美洲株PRRSV的核苷酸序列，設計一對高致病性豬藍耳病病毒的特異性檢測引物，結合先進的病毒核酸提取技術和高效RT-PCR商品試劑，經實驗條件優化，組合而成的一種成熟的一步法RT-PCR檢測試劑盒。該試劑盒能對待檢組織進行直接檢測，檢測過程簡單，抗污染性強。從病料處理到獲得結果只需4小時，結果準確且靈敏度高、特異性好，是目前高致病性豬藍耳病病毒檢測方法非常好的一種替代方法。

本發明的主要技術方案有：

1.引物設計：根據Genbank上的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)變異株(高致病性豬藍耳病病毒)的核苷酸序列與古典美洲株PRRSV的核苷酸序列，設計一對高致病性豬藍耳病病毒的特異性檢測引物，引物詳細為：

Primer?P1：5’-CGTAGAACTGTGACAACAAC-3’

Primer?P2：5’-TGAGTATTTTGGGCGTGTGAT-3’

其中Primer?P1/P2引物對在豬藍耳病病毒核酸中特異性擴增出252bp的產物。

2.待檢病料的核酸提取：采用RNA快速提取方法提取待檢組織樣品的RNA核酸。

3.RT-PCR體系：AMV/Tfl?5×Reaction?Buffer?2.5μL，25mM/L?MgSO₄?1μL，10mM/L?dNTP0.5μL，AMV?Rever?Transcriptase?2.5u，Tfl?DNA?Polymerase?2.5u，20uM/L?Primer?P1?1μL，20uM/L?PrimerP2?1μL，待檢RNA模板5μL，加水至總體積25μL。

4.RT-PCR程序：45℃逆轉錄45min；94℃預變性2min；94℃30s、52℃45s、68℃45s，35個循環；最后68℃延伸8min。4℃保存。

本發明試劑盒組成及保存

Sloution?R?????????7.5mL?×1管????室溫儲存

Wash?buffer????????15mL?×1管?????室溫儲存

ELution?buffer?????1mL?×1管??????室溫儲存

Spin?coLumns???????12個???????????室溫儲存

RNase?Free離心管???24個???????????室溫儲存

RT-PCR體系?????????20μL×10管????-20℃儲存，避免反復凍融。

陽性對照???????????1mL×1管???????-20℃儲存，避免反復凍融。

RNase?Free?H₂O?????1mL×1管???????-20℃儲存