[發明專利]一種基于微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其檢測傳染性病毒的方法

無效

• 申請號: 200810031322.7
• 申請日: 2008-05-16
• 公開（公告）號: CN101271111A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發明（設計）人: 俞汝勤;蔣健暉;沈國勵;楚霞;黃勇
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535;G01N27/327
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司
• 代理人: 馬強

技術領域

本發明屬于生物分析領域，具體涉及一種基于微間隙陣列電極的免疫傳感器，以及利用該免疫傳感器檢測傳染性病毒的方法。

背景技術

傳染病是由病原微生物和寄生物感染人體后產生的有傳染性的疾病。它可在人群中快速傳播并造成流行，對人類的生命和健康造成極大危害。如何有效應對各種急慢性傳染病的暴發、流行和傳播，已成為當今世界各國政府所關注的重大問題之一。目前對傳染性病毒的免疫檢測方法主要有酶聯免疫吸附分析(ELISA)及膠體金免疫層析技術。這些方法雖然比較快速、簡便，但是只能實現定性或半定量的檢測，無法準確測定濃度，更重要的是這些方法不夠靈敏，不能對傳染性疾病進行最早期的診斷，以便采取更及時的措施防止傳染病的擴散。因此，很有必要開發一種更快速、更靈敏的傳染病免疫診斷技術。

發明內容

本發明的目的在于，為克服傳統傳染性疾病免疫檢測方法靈敏度低、不能準確定量的不足，提出一種基于微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其用于檢測傳染性疾病的方法，用于檢測傳染性疾病具有高靈敏、快速、低成本的特點。

本發明的技術方案之一是，所述基于微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器采用微間隙陣列金電極做基片，并采用以下步驟制得：

(1)取常規光刻印刷法制作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極；梳形齒D₁寬為1μm-100μm，間隙D₂為1μm-100μm(參見圖1)；

(2)微間隙陣列金電極的硅烷化處理，過程是：

a.將微間隙陣列金電極用無水乙醇清洗三次，每次1min；

b.將所述電極浸入1M的NaOH溶液中28min-32min，再用超純水清洗該電極三次，每次1min；吹干；

c.將所述電極浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5％(體積百分數)的乙醇溶液中，室溫下靜置23小時-25小時；這樣可在微間隙陣列金電極間的基片上形成一氨基硅烷自組裝單層；

d.用超純水清洗所述電極三次，吹干，即獲得硅烷化的微間隙陣列金電極；

(3)免疫傳感器的制備，步驟是：

a.將所述硅烷化的微間隙陣列金電極浸入質量分數為5％的戊二醛水溶液，室溫下靜置0.8小時-1.2小時；

b.用超純水清洗所述電極三次后，在該電極上滴加30μL傳染性病毒的重組抗原溶液(雙抗原夾心法)或傳染性病毒的特異抗體溶液(雙抗體夾心法)，所述溶液中的重組抗原或特異抗體濃度為100μg/mL，所述溶液系將所述重組抗原或特異抗體溶于0.01M、pH7.4磷酸緩沖溶液中，室溫下靜置反應1小時而得；這樣使得重組抗原或特異抗體通過戊二醛交聯劑固定在微間隙陣列金電極的基片上；

c.用超純水清洗所述電極三次，吹干，即得免疫傳感器，保存于4℃備用。

本發明的技術方案之二是，采用所述基于微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器檢測傳染性病毒的方法，其步驟是：

(1)將20μL感染傳染性病毒的血清或正常血清樣品溶液與20μL堿性磷酸酶標記的重組抗原(雙抗原夾心法)或堿性磷酸酶標記的特異抗體(雙抗體夾心法)溶液混合，滴加在電極上，于室溫下靜置反應0.5小時；重組抗原或特異抗體濃度為10μg/mL，它是將所述重組抗原或特異抗體溶于0.01M、pH7.4磷酸緩沖溶液而得；堿性磷酸酶標記的重組抗原或特異抗體通過感染血清中的抗體或病毒產生的抗原與固定化的重組抗原或特異抗體發生夾心反應而被捕獲到傳感器表面上；

(2)將所述傳感器置于銀沉積溶液中，該銀沉積溶液系將1mM抗壞血酸磷酸酯、2mM?AgNO₃溶于0.1M甘氨酸-NaOH緩沖溶液而得，溶液pH9.0；室溫下靜置反應8min-12min；再從該電極獲取與傳染性病毒抗原或抗體濃度相關的電導或電阻信號。

該步驟(2)中，傳感器表面上堿性磷酸酶催化其底物抗壞血酸磷酸酯水解產生還原劑抗壞血酸，后者將溶液中銀離子還原成銀金屬并沉積在微間隙陣列金電極上，使微間隙陣列金電極正負電極部分導通，從而增大微間隙陣列金電極的電導(或降低電阻)，獲得與血吸蟲抗體濃度相關的電導(或電阻)信號。

本發明為一種基于微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其用于檢測傳染性病毒的方法，它的優點有：

1.微間隙陣列電極制備簡單，可大批量、低成本生產；

2.檢測步驟簡單，檢測時間在1h內，檢測所需的儀器可用萬用電表或自行研制的電阻量測裝置，便攜且價格低廉；