[發明專利]表達頭孢菌素脫乙酰酶的重組大腸桿菌菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 200810031023.3
• 申請日: 2008-04-08
• 公開（公告）號: CN101555463A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發明（設計）人: 鄭華寶;范文超;楊晟;汪慧蓉;曾紅宇;許崗
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院湖州工業生物技術中心;湖南福來格生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所
• 代理人: 顏 勇

技術領域

本發明涉及基因工程及微生物發酵領域，具體涉及表達頭孢菌素脫乙 酰酶的重組菌株及其構建方法。

背景技術

頭孢菌素脫乙酰酶(EC，cephalosporin?C?deacetylase，CE)可催化頭 孢菌素C、7-ACA及其衍生物脫乙酰化反應，其生成的產物用于制備半合成 頭孢菌素抗生素，如頭孢呋辛z(cefuroxime)，S-1108等，在抗生素工 業應用廣泛。

研究表明許多生物體中含有頭孢菌素脫乙酰酶。例如柑桔皮、哺乳動 物肝臟、枯草桿菌、帶小棒鏈霉菌、頂頭孢霉菌、諾卡氏菌、紅酵母菌屬 和黑曲霉等(Takimoto?A，Takakura?T，Tani?H，Yagi?S，Mitsushima?K.2004. Applied?Microbiology?and?Biotechnology?65：263-7)。日本鹽野義制藥 (Shionogi)株式會社篩選到具有頭孢菌素脫乙酰酶活性的枯草芽孢桿菌 SHS0133，已在中國申請了發明專利(光島健二，瀧本明生，八木滋雄，園 山高康，1998，由頭孢菌素乙酰水解酶基因編碼的酶的制備方法， CN98103932)。

本發明創造性地采用基因重組技術構建了兩株能高效表達頭孢菌素脫 乙酰酶的大腸桿菌菌株，該菌株所產生的酶活性穩定，產率符合工業生產 要求，目前，國內外尚未有該重組菌株及其構建方法的相關報道。

發明內容

本發明的目的在于提供兩株表達頭孢菌素脫乙酰酶的重組大腸桿菌。 兩株表達頭孢菌素脫乙酰酶的重組大腸桿菌轉化有重組質粒pMM1384和 pMM1385，這兩種重組質粒均以T7?lac為啟動子，且導入了頭孢菌素脫乙 酰酶基因和卡那霉素基因。兩株重組大腸桿菌已于2007年11月15日在中 國典型培養物保藏中心提交保藏(CCTCC?MM1384、MM1385)，保藏號分別 為CCTCC?M207180，M207181。

本發明的另一目的在于提供上述重組大腸桿菌郡株的構建方法，包括 以下步驟：

1)設計兩對引物，PCR擴增頭孢菌素脫乙酰酶基因：

第一對引物：上游引物CEF：5‘-GGAATTC?CATATG?CAA?CTA?TTC?GAT CTG?CCG-3‘，斜體為Nde?I酶切位點；下游引物CER1：5‘-CCG?CTCGAG GCC?TTT?AAG?ATG?CTG?CTT-3‘，斜體為XhoI酶切位點；

第二對引物：上游引物CEF：5‘-GGAATTC?CATATG?CAA?CTA?TTC?GAT CTG?CCG-3‘，斜體為Nde?I酶切位點，下游引物CER2：5‘-CCG?CTCGAG TCA?GCC?TTT?AAG?ATG?CTG?CTT-3‘，斜體為XhoI酶切位點。

其中PCR擴增條件為，94℃，5min預變性；94℃，30s變性；59℃， 30s退火；72℃，1.5min延伸，共29個循環后保持72℃，10min。

2)篩選陽性克?。?

用Taq酶進行PCR產物加A反應，再與pMD18-T載體連接并轉化宿主 菌DH5α，涂布LB平板，待轉化子長出來后挑取轉化子到LB培養基中培 養，抽取質粒并進行酶切鑒定，挑取陽性克隆。

3)構建重組質粒pMM1384和pMM1385；

用Nde?I和XhoI雙酶切鑒定陽性克隆，膠回收頭孢菌素脫乙酰酶基因 CE1、CE2；用Nde?I和XhoI雙酶切載體pET-24a(+)，膠回收載體片 段；用T4連接酶連接頭孢菌素脫乙酰酶基因片段和載體片段，得到重組質 粒pMM1384和pMM1385。

4)構建表達頭孢菌素脫乙酰酶的兩株重組大腸桿菌：

將重組質粒導入大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)中，構建成表達頭孢菌素 脫乙酰酶的誘導型大腸桿菌重組菌株。

本發明創造性地采用基因重組技術構建了兩株能高效表達頭孢菌素脫 乙酰酶的大腸桿菌菌株，產生的酶活性穩定，產率符合工業生產要求，對 于工業上大規模制備頭孢菌素脫乙酰酶是十分有利的。