[發明專利]表達頭孢菌素脫乙酰酶的重組大腸桿菌菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 200810031023.3
• 申請日: 2008-04-08
• 公開（公告）號: CN101555463A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發明（設計）人: 鄭華寶;范文超;楊晟;汪慧蓉;曾紅宇;許崗
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院湖州工業生物技術中心;湖南福來格生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所
• 代理人: 顏 勇

1.兩株表達頭孢菌素脫乙酰酶的重組大腸桿菌，其特征在于： 兩重組菌株保藏號分別為CCTCC?M207180，M207181。

2.一種構建權利要求1所述重組菌株的方法，包括以下步驟：

1)以枯草芽孢桿菌168基因組為模板，設計兩對引物PCR擴增 頭孢菌素脫乙酰酶基因；

第一對引物：上游引物CEF：5‘-GGAATTCCAA?CTA?TTC? GAT?CTG?CCG-3‘，斜體為Nde?I酶切位點；下游引物CER1：5‘-CCG GCC?TTT?AAG?ATG?CTG?CTT-3‘，斜體為XhoI酶切位點；

第二對引物：上游引物CEF：5‘-GGAATTCCAA?CTA?TTC? GAT?CTG?CCG-3‘，斜體為Nde?I酶切位點，下游引物CER2：5‘-CCG TCA?GCC?TTT?AAG?ATG?CTG?CTT-3‘，斜體為XhoI酶切位點；

2)篩選陽性克隆；

3)構建重組質粒pMM1384和pMM1385；

用Nde?I和XhoI雙酶切鑒定陽性克隆，膠回收頭孢菌素脫乙酰 酶基因CE1、CE2；用Nde?I和XhoI雙酶切載體pET-24a(+)，膠回 收載體片段；用T4連接酶連接頭孢菌素脫乙酰酶基因片段和載體片 段，得到重組質粒pMM1384和pMM1385；

4)構建表達頭孢菌素脫乙酰酶的兩株誘導型大腸桿菌重組菌。

3.根據權利要求2所述的構建重組菌株的方法，其特征在于： PCR擴增條件為，94℃，5min預變性；94℃，30s變性；59℃，30s 退火；72℃，1.5min延伸，共29個循環后保持72℃，10min。