[發(fā)明專利]類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲(chóng)工程菌及其菌劑制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810030426.6
• 申請(qǐng)日: 2008-01-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101230330A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏立秋;丁學(xué)知;曾智;孫運(yùn)軍;張友明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/62;C12N15/57;C12N15/75;C12R1/07
• 代理公司: 長(zhǎng)沙星耀專利事務(wù)所
• 代理人: 寧星耀

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲(chóng)工程菌及其菌劑制備方法，特別是涉及一種含有外源類枯草桿菌蛋白酶基因重組的蘇云金芽胞桿菌工程菌及其菌劑制備方法。

背景技術(shù)

人類長(zhǎng)期大量使用高毒和高殘留的化學(xué)農(nóng)藥，這些化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境、食品安全和人類健康帶來(lái)了眾所周知的負(fù)面作用和影響。因此，減少使用高毒和高殘留的化學(xué)農(nóng)藥勢(shì)在必行，以生物防治為主的害蟲(chóng)防治策略正受到廣泛重視，開(kāi)發(fā)高效穩(wěn)定的微生物農(nóng)藥已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。微生物農(nóng)藥具有無(wú)公害、無(wú)殘留和害蟲(chóng)不容易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，且與人類未來(lái)的生產(chǎn)生活方式、食品安全、營(yíng)養(yǎng)健康、生態(tài)平衡和生物多樣性保護(hù)都具有良好的相融性，在病蟲(chóng)害綜合治理中發(fā)揮了越來(lái)越大的作用，并被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要手段，因而微生物農(nóng)藥的研究開(kāi)發(fā)已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其在形成芽孢的同時(shí)能夠產(chǎn)生伴胞晶體(parasporalcrystal?protein)，其中含有一種或幾種殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal?CrystalProteins，簡(jiǎn)稱ICPs)，即δ-內(nèi)毒素(delta-endotoxin)。伴胞晶體本身無(wú)毒，當(dāng)被敏感昆蟲(chóng)攝入體內(nèi)后，在中腸堿性環(huán)境下分解成原毒素，中腸內(nèi)的蛋白酶對(duì)原毒素進(jìn)行消化，釋放出毒性多肽核心片段(toxincore?fragment)，并與昆蟲(chóng)消化道刷狀緣膜囊(brush?border?memberane?vesicles，簡(jiǎn)稱BBMV)上的受體高親合性結(jié)合，快速而不可逆地插入細(xì)胞質(zhì)膜，形成孔(pore)或病灶(lesion)，引起細(xì)胞膜非極性化，破壞細(xì)胞滲透平衡，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，最后引起昆蟲(chóng)發(fā)生腫脹和厭食而死亡。目前普遍認(rèn)為受體是一種糖蛋白或氨肽酶，關(guān)于ICPs與受體間的作用模式，比較流行的是二步模型，即ICPs先與中腸膜上的受體結(jié)合，然后ICPs插入膜并形成孔。最新研究證實(shí)，ICPs與BBMV的受體結(jié)合是特異的，這種宏觀殺蟲(chóng)機(jī)制已普遍為人們所接受。由于Bt對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)有特異性毒殺作用，具有對(duì)人畜無(wú)害和不危害環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，因此在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和衛(wèi)生害蟲(chóng)防治上得到廣泛應(yīng)用。

目前Bt制劑已達(dá)100多種，是國(guó)內(nèi)外產(chǎn)量最大和應(yīng)用范圍最廣的微生物殺蟲(chóng)劑，它對(duì)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa?armigera)和小菜蛾(Pultella?xylostella)等40多種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)有良好的防治效果，已經(jīng)用來(lái)防治鱗翅目(Lepidopteran)、雙翅目(dipteran)和鞘翅目(coleopteran)的多種害蟲(chóng)。此外Bt還對(duì)膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)和食毛目(Mallophaga)的多種害蟲(chóng)及植物病原線蟲(chóng)、螨類和原生動(dòng)物有控害作用。我國(guó)早在20世紀(jì)50年代就開(kāi)始了Bt殺蟲(chóng)劑的研究和應(yīng)用，到90年代全國(guó)Bt產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量都得到大幅度提高。目前我國(guó)Bt年產(chǎn)量已逾4萬(wàn)噸，產(chǎn)品覆蓋所有省市并銷往歐美以及新西蘭等國(guó)家和地區(qū)。

Bt殺蟲(chóng)劑在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。但是，由于Bt殺蟲(chóng)劑在長(zhǎng)期使用過(guò)程中仍存在一些缺點(diǎn)，如殺蟲(chóng)譜較窄，毒力較化學(xué)殺蟲(chóng)劑弱，殘效期偏短等。并且Bt殺蟲(chóng)劑在長(zhǎng)期施用過(guò)程中，也給昆蟲(chóng)提供了一個(gè)持續(xù)選擇壓力，加快了昆蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生。國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)多種對(duì)Bt伴孢晶體產(chǎn)生抗性作用的害蟲(chóng)，限制了Bt殺蟲(chóng)劑的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。因此不斷分離和鑒定高效廣譜的殺蟲(chóng)晶體蛋白，深入研究其功能結(jié)構(gòu)關(guān)系，以及試圖改變其結(jié)構(gòu)而提高殺蟲(chóng)活性已成為世界各國(guó)Bt研究者的一個(gè)工作重點(diǎn)。采用基因工程技術(shù)構(gòu)建藥效穩(wěn)定和殺蟲(chóng)譜較廣的Bt工程菌制劑，是當(dāng)前Bt農(nóng)藥發(fā)展的新趨勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有Bt殺蟲(chóng)劑殺蟲(chóng)譜較窄，毒力較化學(xué)殺蟲(chóng)劑弱，殘效期偏短等缺陷，提供一種殺蟲(chóng)譜較廣，毒力較強(qiáng)，殘效期較長(zhǎng)的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲(chóng)工程菌及其菌劑制備方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：