[發明專利]類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌及其菌劑制備方法

有效

• 申請號: 200810030426.6
• 申請日: 2008-01-07
• 公開（公告）號: CN101230330A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發明（設計）人: 夏立秋;丁學知;曾智;孫運軍;張友明
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/62;C12N15/57;C12N15/75;C12R1/07
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所
• 代理人: 寧星耀

1.一種類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌，其特征在于，該殺蟲工程菌由蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis)的cry1Ac基因與一種外源毒素基因融合構建的雙效工程菌，并在蘇云金芽胞桿菌中表達融合殺蟲晶體蛋白。

2.按照權利要求1所述的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌，其特征在于，所述蘇云金芽胞桿菌為蘇云金芽胞桿菌4.0718菌株，其保藏號為CCTCCNo.M200016。

3.按照權利要求1或2所述的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌，其特征在于，所述外源毒素基因為球孢白僵菌(Beauveria?bassiana)類枯草桿菌蛋白酶CDEP2基因，其在GenBank上的登錄號為EF195164。

4.按照權利要求1-3之一所述的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶CDEP2基因的克隆

①RT-PCR引物的設計

根據GenBank上登錄號為EF195164的球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因的序列，

CDEP2-F：5’GCGCAGATCTATGCGTCTATCAATCATTGC?3’

CDEP2-R：5’ATACAATTGTTAGGTGGCGCCGTTAAATGC?3’

②RT-PCR獲得球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶CDEP2基因的cDNA全序列

提取球孢白僵菌Bb591的總RNA，以總RNA為模板，CDEP2-R為特異性引物，使用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄獲得CDEP2基因的cDNA第一鏈，以CDEP2基因的cDNA第一鏈為模板，CDEP2-F和CDEP2-R為引物，PCR擴增獲得CDEP2基因的cDNA雙鏈；

③CDEP2基因的cDNA全序列的測序分析

將CDEP2基因的cDNA雙鏈片段與pMD18-T載體進行TA連接，構建克隆載體pMD-CDEP2；將其轉化到大腸桿菌DH5α中，用無菌牙簽從含有氨芐青霉素的LB平板上挑取抗性轉化子做菌落PCR檢測，初步確定陽性轉化子，然后小量制備轉化子質粒，進一步酶切鑒定并將酶切正確的轉化子測序；CDEP2基因的cDNA序列全長1140bp，其在GenBank的登錄號為EF195164；

(2)構建含有cry1Ac基因的中間載體pUAc和表達載體pHAc

①PCR引物的設計

擴增含有上游啟動子序列的cry1Ac基因的引物

Ac-F：5’ACGCGTCGACTTGCAGGTAAATGGTTCTA?3’，下劃線處為Sal?I位點；

Ac-orf-R：5’GCGCAGATCTCTATTCCTCCATAAGGAGTAGTAATTC?3’，下劃線處為BglII位點；

擴增cry1Ac基因下游序列的引物

Ac-Ter-F：5’ACGCAGATCTGCAAACTCAGGTTTAAATATCG?3’，下劃線處為BglII位點；

Ac-R：5’ACGCGGATCCCAAAAACACCCTATTAGTG?3’，下劃線處為BamHI位點；

②中間載體pUAc的構建

提取Bt4.0718菌株的總DNA，以Bt4.0718菌株的總DNA為模板，Ac-F和Ac-orf-R為引物進行PCR擴增，擴增含有上游啟動子序列的3.9kb?crylAc基因；同樣以Bt4.0718菌株的總DNA為模板，Ac-Ter-F和Ac-R為引物進行PCR擴增，擴增288bp?cry1Ac基因下游終止子序列；分別將含有上游啟動子序列的3.9kbcry1Ac基因用BglII酶切后回收，將288bp?cry1Ac基因下游序列用BglII酶切后回收，通過連接得到4.2kb完整的cry1Ac基因片段。以完整的cry1Ac基因片段為模板，Ac-F，Ac-R為引物，擴增4.2kb的完整cry1Ac基因；

用Sal?I/BamH?I雙酶切cry1Ac基因，同樣用Sal?I/BamHI雙酶切載體pUC19，用T₄DNA連接酶將兩者連接起來，形成中間載體pUAc；然后將其轉化大腸桿菌(R.coli)DH5α中擴增，挑選多個轉化子，并提取質粒進行酶切鑒定；

③表達載體pHAc的構建

用Sal?I/BamHI雙酶切中間載體pUAc，回收4.2kb的cry1Ac基因，同樣用Sal?I/BamHI雙酶切穿梭載體pHT315，并回收載體片段，將兩者進行連接，獲得表達載體pHAc；將其轉化E.coli?DH5α中擴增；

(3)Red/ET同源重組構建融合基因表達載體pHT-cry1Ac-CDEP2

①PCR引物設計

Cry1Ac-CDEP2-F：

5’CGGAAGGAACATTTATCGTGGACAGCGTGGAATTACTCCTTATGGAGGAACGTCTATCAATCATTGCTG?3’，下劃線代表上游同源臂序列；

Cry1Ac-CDEP2-R：

5’TGGACAATTGATTTGAAAACGATATTTAAACCTGAGTTTGCATGAGACTAGGTGGCGCCGTTAAATGCCAG?3’，下劃線代表下游同源臂序列；

②構建融合基因表達載體pHT-cry1Ac-CDEP2

利用Red/ET同源重組方法，以pMD-CDEP2為模板，Cry1Ac-CDEP2-F和Cry1Ac-CDEP2-R為引物PCR擴增帶有同源臂序列的CDEP2基因，并回收；提取質粒pHAc，用BglII單酶切后回收；將帶同源臂的CDEP2片段和用BglII單酶切后的pHAc質粒電轉化進大腸桿菌YZ2005中，進行Red/ET同源重組，條件為2.3kV，25uF，200Ω；電擊后的產物加入1mlLB培養基，37℃復蘇75min后將菌液涂布含氨芐青霉素的LB平板，37℃倒置培養過夜；用無菌牙簽從LB平板上挑取轉化子做菌落PCR檢測，初步確定陽性轉化子，然后小量制備轉化子質粒，進一步酶切鑒定并將酶切正確的轉化子測序，重組質粒命名為pHT-cry1Ac-CDEP2；

(4)基因重組殺蟲工程菌菌株Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2的構建

將重組質粒pHT-cry1Ac-CDEP2電轉化Bt無晶體突變株Cry-B中，電轉化條件：1.8KV、25μF、200Ω；通過紅霉素抗性平板初步篩選轉化子，然后通過菌落PCR和SDS-PAGE進一步鑒定和檢測；將正確的轉化子命名為Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2。

5.按照權利要求1-3之一所述的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌菌劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)菌種活化

將保藏在-80℃冰箱中的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌菌株在無菌臺上劃線接種于滅菌的固體種子培養基斜面上，接種后在28～30℃條件下培養30～48h，加入無菌水配成孢子懸液，以5％的接種量接種到種子罐；

(2)種子罐發酵

先將一級種子罐在121℃下滅菌30min，裝入種子培養基后再滅菌，冷卻至30℃，將孢子懸液以5％的接種量接種到種子罐中，30℃培養8小時，可得一級種子罐發酵菌液；將二級種子罐在121℃下滅菌30min，裝入種子培養基后再滅菌，冷卻至30℃，將一級種子罐發酵液按5％～8％接種量接入二級種子罐，30℃培養8小時，可得二級種子罐發酵菌液；

(3)生產發酵罐培養

先將生產發酵罐滅菌，裝入發酵培養基后再滅菌，保壓降溫至25℃～30℃，按5％～8％的接種量將二級種子罐發酵液接入發酵罐中培養；

(4)濃縮

發酵過程結束后，將菌液通過超濾進行濃縮、補加增效添加劑、隨后裝瓶；

所述滅菌的方法及發酵培養條件為：滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在121℃，壓力0.3-0.5kg/cm²條件下滅菌30min。生產發酵罐接種后，在28～35℃條件下培養36～48小時，通氣量1～2Vols/vol/min，氧氣含量30～40％。種子罐培養液配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl0.1～0.6％，MgSO₄·7H₂O?0.01～0.06％，K₂HPO₄?0.01％～0.06％，MnSO₄0.02％～0.08％，pH值滅菌前7.0～7.8，滅菌后pH6.8～7.8。生產發酵罐培養液配方：黃豆粉2～8％，玉米淀粉0.3～1.5％，NaOH0.2～0.8％，在121℃水解20min后，過濾去除雜質，按體積補加葡萄糖1.3～2.0％，KH₂PO₄?0.08～0.22％，K₂HPO₄?0.10～2.2％，CaCO₃?0.1～2.20％，FeSO₄·7H₂O?0.001～0.005％，攪拌均勻，pH值滅菌前8.5～11.0，滅菌后6.5～9.5；發酵液含活芽胞數每毫升達80億以上，菌體量不足5％時放罐，pH值7.0-8.0，無雜菌污染。