[發(fā)明專利]類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌及其菌劑制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810030426.6
• 申請(qǐng)日: 2008-01-07
• 公開（公告）號(hào): CN101230330A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏立秋;丁學(xué)知;曾智;孫運(yùn)軍;張友明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/62;C12N15/57;C12N15/75;C12R1/07
• 代理公司: 長(zhǎng)沙星耀專利事務(wù)所
• 代理人: 寧星耀

1.一種類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌，其特征在于，該殺蟲工程菌由蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis)的cry1Ac基因與一種外源毒素基因融合構(gòu)建的雙效工程菌，并在蘇云金芽胞桿菌中表達(dá)融合殺蟲晶體蛋白。

2.按照權(quán)利要求1所述的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌，其特征在于，所述蘇云金芽胞桿菌為蘇云金芽胞桿菌4.0718菌株，其保藏號(hào)為CCTCCNo.M200016。

3.按照權(quán)利要求1或2所述的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌，其特征在于，所述外源毒素基因?yàn)榍蜴甙捉┚?Beauveria?bassiana)類枯草桿菌蛋白酶CDEP2基因，其在GenBank上的登錄號(hào)為EF195164。

4.按照權(quán)利要求1-3之一所述的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶CDEP2基因的克隆

①RT-PCR引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上登錄號(hào)為EF195164的球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因的序列，

CDEP2-F：5’GCGCAGATCTATGCGTCTATCAATCATTGC?3’

CDEP2-R：5’ATACAATTGTTAGGTGGCGCCGTTAAATGC?3’

②RT-PCR獲得球孢白僵菌類枯草桿菌蛋白酶CDEP2基因的cDNA全序列

提取球孢白僵菌Bb591的總RNA，以總RNA為模板，CDEP2-R為特異性引物，使用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得CDEP2基因的cDNA第一鏈，以CDEP2基因的cDNA第一鏈為模板，CDEP2-F和CDEP2-R為引物，PCR擴(kuò)增獲得CDEP2基因的cDNA雙鏈；

③CDEP2基因的cDNA全序列的測(cè)序分析

將CDEP2基因的cDNA雙鏈片段與pMD18-T載體進(jìn)行TA連接，構(gòu)建克隆載體pMD-CDEP2；將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，用無菌牙簽從含有氨芐青霉素的LB平板上挑取抗性轉(zhuǎn)化子做菌落PCR檢測(cè)，初步確定陽性轉(zhuǎn)化子，然后小量制備轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)一步酶切鑒定并將酶切正確的轉(zhuǎn)化子測(cè)序；CDEP2基因的cDNA序列全長(zhǎng)1140bp，其在GenBank的登錄號(hào)為EF195164；

(2)構(gòu)建含有cry1Ac基因的中間載體pUAc和表達(dá)載體pHAc

①PCR引物的設(shè)計(jì)

擴(kuò)增含有上游啟動(dòng)子序列的cry1Ac基因的引物

Ac-F：5’ACGCGTCGACTTGCAGGTAAATGGTTCTA?3’，下劃線處為Sal?I位點(diǎn)；

Ac-orf-R：5’GCGCAGATCTCTATTCCTCCATAAGGAGTAGTAATTC?3’，下劃線處為BglII位點(diǎn)；

擴(kuò)增cry1Ac基因下游序列的引物

Ac-Ter-F：5’ACGCAGATCTGCAAACTCAGGTTTAAATATCG?3’，下劃線處為BglII位點(diǎn)；

Ac-R：5’ACGCGGATCCCAAAAACACCCTATTAGTG?3’，下劃線處為BamHI位點(diǎn)；

②中間載體pUAc的構(gòu)建

提取Bt4.0718菌株的總DNA，以Bt4.0718菌株的總DNA為模板，Ac-F和Ac-orf-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增含有上游啟動(dòng)子序列的3.9kb?crylAc基因；同樣以Bt4.0718菌株的總DNA為模板，Ac-Ter-F和Ac-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增288bp?cry1Ac基因下游終止子序列；分別將含有上游啟動(dòng)子序列的3.9kbcry1Ac基因用BglII酶切后回收，將288bp?cry1Ac基因下游序列用BglII酶切后回收，通過連接得到4.2kb完整的cry1Ac基因片段。以完整的cry1Ac基因片段為模板，Ac-F，Ac-R為引物，擴(kuò)增4.2kb的完整cry1Ac基因；

用Sal?I/BamH?I雙酶切cry1Ac基因，同樣用Sal?I/BamHI雙酶切載體pUC19，用T₄DNA連接酶將兩者連接起來，形成中間載體pUAc；然后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌(R.coli)DH5α中擴(kuò)增，挑選多個(gè)轉(zhuǎn)化子，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定；

③表達(dá)載體pHAc的構(gòu)建

用Sal?I/BamHI雙酶切中間載體pUAc，回收4.2kb的cry1Ac基因，同樣用Sal?I/BamHI雙酶切穿梭載體pHT315，并回收載體片段，將兩者進(jìn)行連接，獲得表達(dá)載體pHAc；將其轉(zhuǎn)化E.coli?DH5α中擴(kuò)增；

(3)Red/ET同源重組構(gòu)建融合基因表達(dá)載體pHT-cry1Ac-CDEP2

①PCR引物設(shè)計(jì)

Cry1Ac-CDEP2-F：

5’CGGAAGGAACATTTATCGTGGACAGCGTGGAATTACTCCTTATGGAGGAACGTCTATCAATCATTGCTG?3’，下劃線代表上游同源臂序列；

Cry1Ac-CDEP2-R：

5’TGGACAATTGATTTGAAAACGATATTTAAACCTGAGTTTGCATGAGACTAGGTGGCGCCGTTAAATGCCAG?3’，下劃線代表下游同源臂序列；

②構(gòu)建融合基因表達(dá)載體pHT-cry1Ac-CDEP2

利用Red/ET同源重組方法，以pMD-CDEP2為模板，Cry1Ac-CDEP2-F和Cry1Ac-CDEP2-R為引物PCR擴(kuò)增帶有同源臂序列的CDEP2基因，并回收；提取質(zhì)粒pHAc，用BglII單酶切后回收；將帶同源臂的CDEP2片段和用BglII單酶切后的pHAc質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌YZ2005中，進(jìn)行Red/ET同源重組，條件為2.3kV，25uF，200Ω；電擊后的產(chǎn)物加入1mlLB培養(yǎng)基，37℃復(fù)蘇75min后將菌液涂布含氨芐青霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜；用無菌牙簽從LB平板上挑取轉(zhuǎn)化子做菌落PCR檢測(cè)，初步確定陽性轉(zhuǎn)化子，然后小量制備轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)一步酶切鑒定并將酶切正確的轉(zhuǎn)化子測(cè)序，重組質(zhì)粒命名為pHT-cry1Ac-CDEP2；

(4)基因重組殺蟲工程菌菌株Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pHT-cry1Ac-CDEP2電轉(zhuǎn)化Bt無晶體突變株Cry-B中，電轉(zhuǎn)化條件：1.8KV、25μF、200Ω；通過紅霉素抗性平板初步篩選轉(zhuǎn)化子，然后通過菌落PCR和SDS-PAGE進(jìn)一步鑒定和檢測(cè)；將正確的轉(zhuǎn)化子命名為Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2。

5.按照權(quán)利要求1-3之一所述的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌菌劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)菌種活化

將保藏在-80℃冰箱中的類枯草桿菌蛋白酶基因重組殺蟲工程菌菌株在無菌臺(tái)上劃線接種于滅菌的固體種子培養(yǎng)基斜面上，接種后在28～30℃條件下培養(yǎng)30～48h，加入無菌水配成孢子懸液，以5％的接種量接種到種子罐；

(2)種子罐發(fā)酵

先將一級(jí)種子罐在121℃下滅菌30min，裝入種子培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30℃，將孢子懸液以5％的接種量接種到種子罐中，30℃培養(yǎng)8小時(shí)，可得一級(jí)種子罐發(fā)酵菌液；將二級(jí)種子罐在121℃下滅菌30min，裝入種子培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至30℃，將一級(jí)種子罐發(fā)酵液按5％～8％接種量接入二級(jí)種子罐，30℃培養(yǎng)8小時(shí)，可得二級(jí)種子罐發(fā)酵菌液；

(3)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)

先將生產(chǎn)發(fā)酵罐滅菌，裝入發(fā)酵培養(yǎng)基后再滅菌，保壓降溫至25℃～30℃，按5％～8％的接種量將二級(jí)種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)；

(4)濃縮

發(fā)酵過程結(jié)束后，將菌液通過超濾進(jìn)行濃縮、補(bǔ)加增效添加劑、隨后裝瓶；

所述滅菌的方法及發(fā)酵培養(yǎng)條件為：滅菌采用高壓蒸汽滅菌，即在121℃，壓力0.3-0.5kg/cm²條件下滅菌30min。生產(chǎn)發(fā)酵罐接種后，在28～35℃條件下培養(yǎng)36～48小時(shí)，通氣量1～2Vols/vol/min，氧氣含量30～40％。種子罐培養(yǎng)液配方：牛肉膏0.3～0.8％，蛋白胨0.7～1.2％，葡萄糖0.1～0.6％，NaCl0.1～0.6％，MgSO₄·7H₂O?0.01～0.06％，K₂HPO₄?0.01％～0.06％，MnSO₄0.02％～0.08％，pH值滅菌前7.0～7.8，滅菌后pH6.8～7.8。生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方：黃豆粉2～8％，玉米淀粉0.3～1.5％，NaOH0.2～0.8％，在121℃水解20min后，過濾去除雜質(zhì)，按體積補(bǔ)加葡萄糖1.3～2.0％，KH₂PO₄?0.08～0.22％，K₂HPO₄?0.10～2.2％，CaCO₃?0.1～2.20％，F(xiàn)eSO₄·7H₂O?0.001～0.005％，攪拌均勻，pH值滅菌前8.5～11.0，滅菌后6.5～9.5；發(fā)酵液含活芽胞數(shù)每毫升達(dá)80億以上，菌體量不足5％時(shí)放罐，pH值7.0-8.0，無雜菌污染。