[發(fā)明專利]一種分泌表達(dá)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810030155.4
• 申請日: 2009-02-17
• 公開（公告）號: CN101538571A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李校堃;王曉杰;張?jiān)讫?/a>;田海山;王會巖;黃志鋒;黃亞東;王艷芳;姚娜;楊萍;肖業(yè)臣;劉孝菊;肖健
• 申請（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)學(xué)院;廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司;吉林農(nóng)大生物反應(yīng)器工程有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/475;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種分泌表達(dá)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的制備方法，其特征在于，

提供優(yōu)化的表達(dá)人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的表達(dá)載體pET22b(+)，并將編碼人角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2的DNA序列插入該表達(dá)載體pET22b(+)中，得到重組質(zhì)粒pET22b(+)-rhKGF-2，所述表達(dá)載體pET22b(+)含有分泌信號肽編碼序列，能將KGF-2蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)；

將轉(zhuǎn)入pET22b(+)-rhKGF-2的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆，接種到含50ml?LB培養(yǎng)基的250ml三角燒瓶中，培養(yǎng)3～4hr，待OD₆₀₀達(dá)到0.8～1.0，按1∶10的比例接種于含250ml改良種子培養(yǎng)基的1000ml三角燒瓶中，培養(yǎng)8～10h，待OD₆₀₀達(dá)到6～8，按1∶10上罐發(fā)酵，流加甘油、鎂鹽、和氨水調(diào)節(jié)pH6.8～7.0，溫度37℃、DO＞30％，待OD₆₀₀達(dá)到15～18，加入0.5～0.8mM?IPTG開始誘導(dǎo)，補(bǔ)加甘油、氮源、磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH7.2～7.4、DO＞50％，溫度30～32℃，誘導(dǎo)4～5hr結(jié)束；

其中，LB培養(yǎng)基含1％蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl；改良種子培養(yǎng)基含1％酵母提取物、1％蛋白胨、0.3％K₂HPO₄、0.12％KH₂PO₄、0.4％NaCl、和0.5％葡萄糖；罐內(nèi)培養(yǎng)基含2.3％蛋白胨、1.7％酵母提取物、0.3％K₂HPO₄、0.12％KH₂PO₄、0.4％(NH₄)Cl、0.1％MgSO₄、0.1％微量元素、和0.5％糖蜜；

采用凍融破碎發(fā)酵菌體，低溫高速離心棄沉淀，收上清；

通過超濾對破菌液上清液進(jìn)行初步純化；和

依次陽離子交換層析和親和層析純化。?