[發明專利]一種分泌表達重組人角質細胞生長因子-2的制備方法

無效

• 申請號: 200810030155.4
• 申請日: 2009-02-17
• 公開（公告）號: CN101538571A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 李校堃;王曉杰;張云龍;田海山;王會巖;黃志鋒;黃亞東;王艷芳;姚娜;楊萍;肖業臣;劉孝菊;肖健
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院;廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司;吉林農大生物反應器工程有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/475;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及一種優化分泌表達重組人角質細胞生長因子(rhKGF-2)的制備方法，以及用于該方法的表達載體和宿主細胞。

背景技術

角質細胞生長因子(keratinocyte?growth?factor，KGF)是在1989年由Rubin等從人胎肺成纖維細胞的培養上清中分離并純化的，并發現具有促進小鼠角質細胞有絲分裂的作用，故將其定名為角質細胞生長因子。1996年Yamasaki等從鼠的胚胎中擴增出一種新的生長因子，即與KGF密切相關的另一種新的細胞因子，稱為KGF-2，又叫作成纖維細胞生長因子-10(FGF-10)。之后Emoto等從人肺中克隆到人KGF-2的cDNA，該基因定位于人第5號染色體5p12-5p13，人FGF-10由624個核甘酸組成，編碼208個氨基酸，分子量為19.3KD，與KGF-1有57％的同源性。KGF-2主要由間充質細胞合成，通過與上皮細胞細胞膜上的受體作用，特異性促進上皮細胞的增殖、分化和遷移，是胚胎器官發育中重要的多功能信號分子。

KGF-2與KGF-1的生物學功能到目前研究為止有許多相同之處，如都能增加表面外胚層來源的上皮細胞增生，對其它細胞則無作用；由間充質細胞產生，以旁分泌的方式作用于上皮細胞等。但KGF-2在促進創傷愈合、減少瘢痕形成等方面優于KGF-1，這些特點使KGF-2更適合于開發新的治療創傷的基因工程藥物。

KGF-2能夠通過刺激表皮細胞的增殖、遷移和分化直接促進傷口的愈合，在組織的重塑過程中起趨化作用。KGF-2通過與損傷位點黏膜的表皮細胞上的受體結合，引起細胞向受傷處遷移，保護角質細胞免受ROS誘導的細胞凋亡，由此來加快傷口的愈合。此外，KGF-2同時也能通過刺激其他在組織修復和再生過程中有著非常重要作用的細胞因子(如血小板衍生生長因子、轉化生長因子和成纖維細胞生長因子)的表達來間接作用于組織的重塑。

KGF-2對皮膚的切口損傷修復過程有明顯的改善，可用于加速外科手術后的傷口愈合。此外，KGF-2對移植皮膚的愈合也具有極顯著的促進作用。這可能是因為它能夠增加傷口處的機械張力和傷口膠原蛋白含量，促進表皮細胞的生長，加快上皮和肉芽組織的形成，加速創口愈合。因此KGF-2可能是細胞內起動和加速傷口愈合的一個十分重要的媒介物。同時有研究表明，在這一過程中KGF-2能夠增加TGF-α和PDGF-AB的分泌，而這一效應說明KGF-2可能正是作用于角質細胞、纖維原細胞和內皮細胞，以及促進表皮再生的媒介分子。

KGF-2對于異體骨髓移植后引起的移植物抗宿主病也有一定的抑制作用。異體骨髓移植是惡性血液疾病的首選治療方法，這個方法的效果與移植物抗白血病反應有很大的關系，而GVHD則是使骨髓移植受限的主要因素，是異體骨髓移植術后的主要并發癥，急性GVHD主要引起皮膚、肝臟和腸道等多器官上皮細胞壞死。Clouthier等用鼠科動物BMT模型B63B6D2F1來研究KGF-2對于GVHD的影響。受試小鼠在給予KGF-2(每天5mg/kg)后，全身性的GVHD和靶器官的組織病理方面均有明顯的降低。與對照組相比，KGF-2同時還導致小鼠的血清中腫瘤壞死因子-α水平和脂多糖水平的下降。相反，KGF-2并不影響T細胞的增殖、細胞因子的產生或對抗宿主抗原的細胞毒反應。

動物模型的研究表明，在預防輻射對正常機體造成的損傷方面，KGF-2有非常顯著的作用。它能提高骨髓對全身輻射的耐受性，保護小腸隱窩免受輻射損傷，降低輻射引起的胃腸道損傷，預防粘膜炎的發生，并能調節和維持干細胞的分裂及存活。此外，KGF-2對潰瘍和腸炎也有很好的療效，靜脈注射KGF-2幾乎能完全恢復小鼠腸道表面的正常細胞構造，顯著降低急性和慢性腸損傷。持續的KGF-2給藥，能維持小鼠正常體重，改善宏觀和微觀腸炎癥和潰瘍，并且沒有明顯的毒副作用。目前，美國人類基因組科學公司正在進行三項KGF-2的II期臨床實驗：一是靜脈潰瘍；二是骨髓移植前高劑量化療引起的粘膜炎；三是潰瘍性大腸炎。其中靜脈潰瘍的實驗已基本完成，實驗結果顯示了KGF-2良好的療效和安全性。KGF-2作為一種新型多肽類藥物有著廣闊的開發和應用前景。