[發明專利]從人血漿組分FIV沉淀中分離純化α1－抗胰蛋白酶的方法

有效

• 申請號: 200810027373.2
• 申請日: 2008-04-11
• 公開（公告）號: CN101274956A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 朱光祖;呂應年
• 申請（專利權）人: 三九集團湛江開發區雙林藥業有限公司
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18;C07K1/34;C07K1/14;C07K14/81
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人: 劉菁菁

技術領域

本發明涉及一種α1-抗胰蛋白酶的制備方法，尤其是從人血漿組分沉淀中分離純化α1-抗胰蛋白酶的方法。

背景技術

α1-AT主要是由肝細胞合成的一種糖蛋白，分子量54KD，體內半衰期6d。α1-AT是人血漿中最豐富的一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，能抑制多種絲氨酸內切肽酶，如抑制彈性蛋白酶、胰蛋白酶、纖溶酶、膠原酶、凝血酶和Hageman因子等的活性。α1-AT是血液中最主要的抗胰蛋白酶，占血清胰蛋白酶抑制活性的90％以上。α1-AT具有較強的血管通透性，在肺組織中濃度高，而且對彈性蛋白酶活性更專一，它的主要生理功能是抑制肺部彈性蛋白酶的活性，保護肺部不受彈性蛋白酶的酶解損傷。

人體血漿中α1-AT缺乏直接相關的疾病主要是肺和肝臟疾病。如阻塞性肺氣腫、新生兒或成人呼吸窘迫綜合征、肺部囊性纖維化、兒童肝硬化和新生兒肝炎等，病情嚴重導致患兒夭折。

對于α1-AT缺乏癥的治療主要是進行替代治療和基因治療。但由于基因療法目前尚處于實驗階段，具有一定的局限性，因此α1-AT替代或補充治療此類疾病是主要方法。我國目前尚無該產品的生產，市場需求主要依靠進口產品來滿足。

國內外都開展了α1-AT的生產研究。Gadek等應用兩步沉淀過程制備臨床應用的α1-AT濃縮制劑，α1-AT僅占濃縮制劑蛋白總量的5％。Glaser等建立了獨特的α1-AT制備工藝，采用二硫蘇糖醇處理結合硫酸銨沉淀，DEAE-纖維素層析，從Cohn’s低溫乙醇工藝的廢棄組分FIV-1中提純出純度70％的α1-AT濃縮制劑。朱威等^[9]從Cohn組分FIV中提純α1-AT。將Cohn組分FIV抽提液經沉淀，超濾，離子交換及凝膠過濾后，提純α1-AT，用巴氏法滅活病毒，并考察其效果。用免疫單擴散、雙向交叉免疫電泳、SDS-PAGE及合成基質法檢測α1-AT蛋白活性，用區帶掃描法測其純度達90％以上。

上述工藝主要采用沉淀法或沉淀結合層析法純化α1-AT，產品純度在70％-90％左右，純度較低；本發明采用兩步層析法純化，設備儀器少，操作簡單易行，產品純度高，α1-AT電泳純度達到98％。

發明內容

本發明的目的是為了彌補現有技術的不足，提供一種新的從人血漿組分FIV沉淀中分離純化α1-抗胰蛋白酶的方法，以降低生產成本及提高純度。

為了達到上述發明目的，本發明采用了以下技術方案：

一種從人血漿組分FIV沉淀中分離純化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步驟：

(A)血漿沉淀預處理：取FIV沉淀加溶解液稀釋到蛋白含量2％～5％，pH8.0～8.5，離子強度0.09-0.12，溫度控制在2～8℃攪拌過夜，按照0.5％～15％的比例(W/V)加入硅酸鹽助劑在2-8℃攪拌1h，固液分離，取上清液，按照0.5％-15％的比例(W/V)再次加入硅酸鹽助劑在2-8℃攪拌3h，固液分離，取上清液進樣層析柱；

(B)陰離子凝膠層析：取凝膠，室溫放置達到溫度平衡后裝柱，以緩沖液洗脫平衡，pH6.0～6.5，平衡量為柱體積的8～12倍，將上清液上樣于平衡好的層析柱，用緩沖液洗脫，pH6.0～6.5，溫度控制在2～8℃，洗柱8～10倍柱體積，于紫外光280nm波長下自動監測，記錄層析圖譜，選擇性地收集以含有a?1-AT為主要成分的組分；

(C)凝膠過濾層析：取凝膠，室溫放置達到溫度平衡后裝柱，以緩沖液平衡，將層析后收集的a1-AT的組分調至pH?7.0-7.5，上樣于平衡好的Sephacryl5-200柱，用相同的緩沖液洗脫，同時于紫外光280nm波長下自動監測，記錄層析圖譜，選擇性地收集a?1-AT的組分；

(D)超濾脫鹽濃縮；

(E)巴氏病毒滅活：將濃縮蛋白液加無熱原注射用水稀釋，加入保護劑，于60±0.5℃保溫8～12小時，滅活血漿蛋白制品中的病毒；

(F)凍干分裝：巴氏滅活的a?1-AT蛋白液經除菌過濾，轉入凍干機真空凍干；

(G)干熱消毒：分裝的凍干粉針放置于保溫庫中保溫，滅活病毒，轉入成品庫全檢包裝。

本發明是以人血白蛋白生產過程中產生的棄料FIV組分沉淀為原料，采用層析技術分離純化一種蛋白酶抑制劑即α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)，建立α1-AT濃縮制劑的生產工藝。本方法制備的產品純度好、收率高，操作簡單易行，同時占用設備少、勞動強度小、能耗低，以白蛋白生產的廢棄物料作原料，生產成本低。

附圖說明

圖1為工藝流程圖。