[發明專利]從人血漿組分FIV沉淀中分離純化α1－抗胰蛋白酶的方法

有效

• 申請號: 200810027373.2
• 申請日: 2008-04-11
• 公開（公告）號: CN101274956A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 朱光祖;呂應年
• 申請（專利權）人: 三九集團湛江開發區雙林藥業有限公司
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18;C07K1/34;C07K1/14;C07K14/81
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人: 劉菁菁

1.一種從人血漿組分FIV沉淀中分離純化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步驟：

(A)血漿沉淀預處理：取FIV沉淀加溶解液稀釋到蛋白含量2％～5％，pH8.0～8.5，離子強度0.09-0.12，溫度控制在2～8℃攪拌過夜，按照0.5％～15％的比例(W/V)加入硅酸鹽助劑在2-8℃攪拌1h，固液分離，取上清液，按照0.5％-15％的比例(W/V)再次加入硅酸鹽助劑在2-8℃攪拌3h，固液分離，取上清液進樣層析柱；

(B)陰離子凝膠層析：取凝膠，室溫放置達到溫度平衡后裝柱，以緩沖液洗脫平衡，pH6.0～6.5，平衡量為柱體積的8～12倍，將上清液上樣于平衡好的層析柱，用緩沖液洗脫，pH6.0～6.5，溫度控制在2～8℃，洗柱8～10倍柱體積，于紫外光280nm波長下自動監測，記錄層析圖譜，選擇性地收集以含有a?1-AT為主要成分的組分；

(C)凝膠過濾層析：取凝膠，室溫放置達到溫度平衡后裝柱，以緩沖液平衡，將層析后收集的a1-AT的組分調至pH?7.0-7.5，上樣于平衡好的Sephacryl5-200柱，用相同的緩沖液洗脫，同時于紫外光280nm波長下自動監測，記錄層析圖譜，選擇性地收集a?1-AT的組分；

(D)超濾脫鹽濃縮；

(E)巴氏病毒滅活：將濃縮蛋白液加無熱原注射用水稀釋，加入保護劑，于60±0.5℃保溫8～12小時，滅活血漿蛋白制品中的病毒；

(F)凍干分裝：巴氏滅活的a?1-AT蛋白液經除菌過濾，轉入凍干機真空凍干；

(G)干熱消毒：分裝的凍干粉針放置于保溫庫中保溫，滅活病毒，轉入成品庫全檢包裝。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟A的溶解液為為8～18mM的磷酸鹽緩沖液或30～35mM的醋酸鹽緩沖液；溶解液中添加的助劑為硅藻土、珍珠巖，添加劑的用量為每100毫升溶解液添加0.5克-15克。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟A中的固液分離采用高速離心分離或板框加壓過濾，分離溫度控制在4℃，固液分離后上清液調節到pH5.5-6.5。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟B中離子交換層析填料為DEAF-Sepharose?Fast?Flow凝膠，洗脫液為8～18mM的磷酸鹽緩沖液或30～35mM的醋酸鹽緩沖液或12～25mM的檸檬酸鹽緩沖液，流速控制在2.0～4.5L/h。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟C中凝膠過濾層析填料為Sephacryl?S-200凝膠，洗脫液為8～18mM的磷酸鹽緩沖液或30～35mM的醋酸鹽緩沖液或12～25mM的檸檬酸鹽緩沖液，pH7.0-7.5，洗脫量為柱體積的8-12倍，流速控制在每小時1.5～3.5倍柱體積，洗脫溫度控制在2-8℃。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟D是將經層析純化的a?1-AT溶液泵入超濾機，用無熱原注射用水超濾脫鹽，超濾膜截留分子量為100KD。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟E稀釋到蛋白含量控制在1.5％-2.5％，pH6.4-6.8。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟E中巴氏消毒的保護劑為甘氨酸和麥芽糖混合保護劑，甘氨酸含量控制在45-55mM，麥芽糖含量控制在25％-35％。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟F中所述除菌過濾采用的除菌膜孔徑0.22um，真空凍干含水量控制在3％以下。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟G中凍干制品的保溫溫度為80℃，保溫時間為60～72小時。