[發明專利]具有兩條活性X染色體的人孤雌胚胎干細胞系及其衍生物

無效

• 申請號: 200810026658.4
• 申請日: 2008-03-07
• 公開（公告）號: CN101525592A
• 公開（公告）日: 2009-09-09
• 發明（設計）人: 孫筱放
• 申請（專利權）人: 廣州醫學院
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 劉宇峰

1、一種具有兩條活性X染色體的人孤雌胚胎干細胞系及其衍生物，其特征在于：

(a)該人孤雌胚胎干細胞系及其衍生物的核型在10代以前是“46，XX”；從第20代開始，部分細胞發生了一條活性X染色體的丟失，該細胞系的核型變成了嵌合體“46，XX/45，X0”；隨著代次的增加，45，X0的分裂相比例增加；到了第35代，核型為“45，X0”，該細胞系的所有細胞都發生了一條活性X染色體的丟失；

(b)在第15代核型“46，XX”和第30代核型“46，XX/45，X0”中沒有失活的X染色體存在，在X染色體失活的檢測中，一直維持只有活性X染色體的狀態，而沒有發現有失活的X染色體的存在；

(c)該人孤雌胚胎干細胞系及其衍生物是通過以下步驟制備的：

a.獲得成熟的處于第二次減數分裂中期的卵母細胞；

b.激活卵的第二極體排出，促使其雌原核加倍形成純合二倍體，培養該激活的細胞，誘導該細胞成為含有可辨別的內細胞團和滋養外胚層的胚胎；

c.分離所述內細胞團，轉入可抑制細胞分化的培養基中培養，使這些細胞保持未分化的多能狀態，并傳代、冷凍，經各種方法鑒定，確認為孤雌胚胎干細胞系及其衍生物。

2、根據權利要求1所述的人孤雌胚胎干細胞系及其衍生物，其特征在于，所述制備的步驟a包括：

收集卵冠丘復合物，在含5-10％血清替代品的培養液中培養0.5-1小時；

將該卵冠丘復合物曝露于80IU/ml的透明質酸酶中20秒～1分鐘，去除顆粒細胞，在含Hepes的培養液中洗滌數次；以及

顯微鏡下觀察，選擇成熟的MII期卵母細胞進行下一步的孤雌激活。

3、根據權利要求1所述的人孤雌胚胎干細胞系及其衍生物，其特征在于，所述制備的步驟b包括：

將該卵母細胞在含5μM-10mM鈣離子載體的早期胚胎培養液中作用3-5分鐘；

轉入含1-5mM蛋白磷酸化抑制劑6-二甲氨基吡啶即6-DMAP和1nM-1mM組蛋白去乙酰化酶抑制劑的早期胚胎培養液中作用4-6小時；

顯微鏡下檢查證實排出第二極體后，繼續在含1nM-1mM組蛋白去乙酰化酶抑制劑的早期胚胎培養液中激活8-12小時；

洗去組蛋白去乙酰化酶抑制劑，將卵母細胞轉入早期胚胎培養液中培養的2-3天，然后囊胚培養液再培養2-3天，形成早期囊胚；

將早期囊胚移入含有1000-2000IU/ml人重組白血病抑制因子和2-10ng/ml的人堿性成纖維細胞生長因子的囊胚優化培養基繼續培養2-3天，獲得所述的具有兩條活性X染色體的人孤雌胚胎干細胞系。