[發(fā)明專利]淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因及其克隆方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810026627.9
• 申請日: 2008-03-05
• 公開（公告）號: CN101265476A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發(fā)明（設計）人: 卓侃;廖金鈴
• 申請（專利權）人: 華南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/10
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 林麗明;任重

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因及其克隆方法。

背景技術

植物寄生線蟲是引起作物病害十分重要的病原物之一，對農(nóng)業(yè)造成巨大的危害。目前主要采用殺線蟲劑防治植物寄生線蟲，但殺線蟲劑通常毒性較高，污染環(huán)境。目前植物線蟲的生物防治越來越受到人們的重視。目前已有包括線必克等商品化的線蟲生防制劑上市。

真菌是植物線蟲生物防治中研究較多的天敵生物，也是最為重要的生防因子之一。淡紫擬青霉(Paecilomyces?lilacinus)是其中最為著名、也是最重要的線蟲生防真菌之一。研究表明淡紫擬青霉可以寄生線蟲的卵，抑制卵的孵化。線蟲的卵殼主要包含三層：最外層的卵黃磷層、中間的幾丁質(zhì)層和最里面的脂質(zhì)層，它們共同形成保護卵的屏障。淡紫擬青霉在接觸線蟲卵后，菌絲會形成附著胞，然后附著胞會分泌一些細胞溶解酶。這些酶在真菌的侵染過程中起了很重要的作用，其中最重要的是幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶。研究認為幾丁質(zhì)酶可以降解卵的中間層-幾丁質(zhì)層，幾丁質(zhì)是N-乙酰1-β-D葡萄糖胺以β-1，4糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物，其中幾丁質(zhì)酶中的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶可以隨機切斷幾丁質(zhì)鏈，生成殼二糖及少量殼三糖，外切幾丁質(zhì)酶可以切斷殼二糖和N-乙酰1-β-D葡萄糖胺。Khan等(2004)用純化的幾丁質(zhì)酶處理爪哇根結線蟲的卵，通過透射電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)用幾丁質(zhì)酶處理的線蟲卵殼的幾丁質(zhì)層產(chǎn)生大量的液泡并且卵黃磷層開裂；而用幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶共同處理卵時，卵結構被損壞的程度更明顯，脂質(zhì)層被破壞、幾丁質(zhì)層被水解、卵黃磷層則喪失了完整性。

因此，從淡紫擬青霉中獲取幾丁質(zhì)酶基因，利用生物基因工程技術對現(xiàn)有的生防菌株基因組DNA進行改造，增加幾丁質(zhì)酶基因的拷貝數(shù)和表達水平，對提高生防菌的防效具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是填補現(xiàn)有技術的空白，提供線蟲生防菌淡紫擬青霉一個新的幾丁質(zhì)酶基因。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述基因的克隆方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術方案來予以實現(xiàn)：

提供一種線蟲生防菌淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因，基因序列表如SEQ?ID?NO：2。

本發(fā)明同時提供了所述淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的克隆方法，包括以下步驟：

(1)利用幾丁質(zhì)誘導淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶活性，收集酶活最高的真菌菌絲和孢子，采用Trizol試劑法提取總RNA，并利用GeneRacer^TM?kit和BD?SMART?RACE?cDNA?Amplication?Kit反轉錄成一鏈cDNA分別作為3′RACE和5′RACE的模板；

(2)選擇GenBank上昆蟲及真菌生防菌的幾丁質(zhì)酶基因序列，利用ClustalX軟件進行同源性分析，根據(jù)保守序列設計一對簡并引物擴增獲得淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶基因片段680bp；

(3)根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因片段設計特異引物，運用SMART?RACERT-PCR技術從淡紫擬青霉cDNA一鏈中獲得基因5’端和3’端序列，將三段序列進行拼接得到淡紫擬青霉cDNA全長序列；

(4)根據(jù)淡紫擬青霉cDNA全長序列設計一對覆蓋ORF的特異引物，以淡紫擬青霉DNA為模板，擴增獲得淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶基因的基因組編碼區(qū)序列1436bp，編碼區(qū)包含3個內(nèi)含子，序列表如SEQ?IDNO：1。

步驟(1)所述幾丁質(zhì)誘導淡紫擬青霉的幾丁質(zhì)酶活性優(yōu)選菌株第7天的淡紫擬青霉幾丁質(zhì)酶。

步驟(2)所述GenBank上昆蟲及真菌生防菌的索引號為X64104、AY147010、AY147011、S78423、AY758401、AY758398、AJ243014、AY705926、AY705927、AF188921、U49455和AY292527。

步驟(2)所述簡并引物為：

上游引物Chi2a：5′-TTGGAAHGAYGWYGGMAMYAAYGC-3′；

下游引物Chi2d：5′-CYYTRTARTCCCAKRYRCCRTHYTC-3′；

簡并堿基代碼：H＝A/C/T，Y＝C/T，W＝A/T，M＝A/C，R＝A/G，K＝G/T。

步驟(3)包括以下步驟：