[發明專利]淡紫擬青霉幾丁質酶基因及其克隆方法

無效

• 申請號: 200810026627.9
• 申請日: 2008-03-05
• 公開（公告）號: CN101265476A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 卓侃;廖金鈴
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/10
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 林麗明;任重

1、一種淡紫擬青霉幾丁質酶基因，其特征在于所述幾丁質酶基因的序列表如SEQ?ID?NO：2。

2、一種權利要求1所述淡紫擬青霉幾丁質酶基因的克隆方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)利用幾丁質誘導淡紫擬青霉的幾丁質酶活性，收集酶活性最高的真菌菌絲和孢子，采用Trizol試劑法提取總RNA，并利用GeneRacer^TM?kit和BD?SMART?RACE?cDNA?Amplication?Kit反轉錄成一鏈cDNA分別作為3′RACE和5′RACE的模板；

(2)選擇GenBank上昆蟲及真菌生防菌的幾丁質酶基因序列，利用ClustalX軟件進行同源性分析，根據保守序列設計一對簡并引物擴增獲得淡紫擬青霉的幾丁質酶基因片段680bp；

(3)根據幾丁質酶基因片段設計特異引物，運用SMART?RACERT-PCR技術從淡紫擬青霉cDNA一鏈中獲得基因5’端和3’端序列，將三段序列進行拼接得到淡紫擬青霉cDNA全長序列；

(4)根據淡紫擬青霉cDNA全長序列設計一對覆蓋ORF的特異引物，以淡紫擬青霉DNA為模板，擴增獲得淡紫擬青霉幾丁質酶基因的基因組編碼區序列1436bp，編碼區包含3個內含子，序列表如SEQ?IDNO：1。

3、根據權利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質酶基因的克隆方法，其特征在于步驟(1)所述幾丁質誘導淡紫擬青霉優選菌株誘導第7天的淡紫擬青霉幾丁質酶。

4、根據權利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質酶基因的克隆方法，其特征在于步驟(2)所述GenBank上昆蟲及真菌生防菌的索引號為X64104、AY147010、AY147011、S78423、AY758401、AY758398、AJ243014、AY705926、AY705927、AF188921、U49455和AY292527。

5、根據權利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質酶基因的克隆方法，其特征在于步驟(2)所述簡并引物為：

上游引物Chi2a：5′-TTGGAAHGAYGWYGGMAMYAAYGC-3′；

下游引物Chi2d：5′-CYYTRTARTCCCAKRYRCCRTHYTC-3′；

簡并堿基代碼：H＝A/C/T，Y＝C/T，W＝A/T，M＝A/C，R＝A/G，K＝G/T。

6、根據權利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質酶基因的克隆方法，其特征在于步驟(3)包括以下步驟：

(a)根據淡紫擬青霉幾丁質酶基因片段680bp，設計一條特異上游引物Chit1與GeneRacer^TM?kit中的接頭引物GeneRacer^TM?3′Primer配對，進行3′RACE末端擴增，獲得包含3′非編碼區在內的1025bp基因片段，可與上述680bp片段連接；

(b)根據上述3′端基因片段，設計特異下游引物Chitin3和Chitin1分別與BD?SMART?RACE?cDNA?Amplication?Kit中的UPM?short接頭引物和巢式錨定引物NUP配對，經過兩輪擴增獲得包含5′非編碼區在內的530bp基因片段，可與上述的3′端基因片段連接上；

(c)利用SeqMan軟件將上述片段進行拼接，得到cDNA全長片段。

7、根據權利要求6所述淡紫擬青霉幾丁質酶基因的克隆方法，其特征在于步驟(a)所述特異上游引物為：

Chit1：5′-GTGACGATTATGAAGGACTGGGGAT-3′。

8、根據權利要求6所述淡紫擬青霉幾丁質酶基因的克隆方法，其特征在于步驟(b)所述特異下游引物為：

Chitin3：5′-TTTGTCCGATGATGCTTCCCAGA-3′；

Chitin1：5′-TCCCCAGTCCTTCATAATCGTCAC-3′。

9、根據權利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質酶基因的克隆方法，其特征在于步驟(4)所述特異引物為：

上游引物Zkf：5′-GCAGCATGAGGCGATATTTGGTG-3′；

下游引物Zkr：5′-TTGACGGAGTATGTAAGGCGACG-3′。

10、根據權利要求2所述淡紫擬青霉幾丁質酶基因的克隆方法，其特征在于還包括利用DNAStar軟件對淡紫擬青霉的幾丁質酶基因PLC全序列進行核苷酸序列分析，對該基因編碼的氨基酸序列進行同源性分析，確認淡紫擬青霉的幾丁質酶基因。