[發明專利]紫芝溶栓酶的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 200810026516.8
• 申請日: 2008-02-28
• 公開（公告）號: CN101235367A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 程京燕;蘇保榮;徐鳳彩
• 申請（專利權）人: 程京燕
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;A61K38/48;A61P7/02;C12R1/645
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人: 楊煥軍

技術領域

本發明涉及一種溶栓酶的制備方法及該溶栓酶的用途，尤其涉及一種從紫芝中制備溶栓酶的方法以及所制備的溶栓酶在制備治療血栓栓塞性疾病藥品中的應用。

背景技術

血栓栓塞性疾病是危害人們健康和生命的主要疾病之一，目前由于各種原因引起的血液栓塞疾病，如腦血栓、心肌梗塞、冠心病、肢體血管栓塞等的發病率呈上升趨勢，其中，全世界約有1500萬血栓栓塞性疾病患者，其發病率、致殘率和死亡率都很高，嚴重威脅人類的健康和生命。造成血栓栓塞性疾病的主要原因之一是由于血管內形成血栓，臨床表現為急性心肌梗塞、腦血栓中風和脈管栓塞。

治療血栓栓塞性疾病的方法主要有以下三種：第一，外科手術，即用物理方法清除血栓或切除栓塞部位的血管而用塑料管取代；這種方法要求的條件復雜、費用高，且手術后易再栓塞。第二，保守療法，讓患者長期服用抗凝劑，減低凝血傾向；這種方法通常與其它方法結合作為輔助治療。第三，溶栓療法，即注射溶栓劑使血管疏通。溶栓療法是目前治療血栓栓塞性疾病的最有效途徑之一。

目前，國內外上市或正在研究的溶栓藥很多，從原料來源可分為3類：

1、基因重組產品，如重組鏈激酶、重組水蛭素等；

2、生物工程產品，如葡萄酶、納豆激酶等；

3、生化藥品，如尿激酶、降纖酶、蛇毒溶栓酶、蚓激酶等。

在現行臨床所用的溶栓劑中主要是鏈激酶(SK)和尿激酶(UK)，但這兩種藥物都有其局限性：鏈激酶由于人體內易產生鏈激酶抗體，因此存在拮抗作用，用量不好掌握，并具有明顯的副作用；尿激酶雖然無明顯的抗原性，但因尿激酶很不穩定，活性難以控制，容易引起大出血或者因失活而起不到溶解血栓的作用。同時，這些溶栓劑的制備工藝復雜，價格昂貴，難以廣泛推廣應用。

鑒于目前已經商品化的溶栓藥劑的來源困難，生產工藝復雜等因素，使該類產品的產量受到限制，因而直接影響到疾病的治療，例如尿激酶由收集尿液、儲運、消臭等程序，對環境衛生造成不良的后果，影響周邊居民的生活；同時，由于天氣的變化，尿液容易變質，從而直接影響生產的產量；而利用納豆生產的納豆激酶由于野生型納豆芽孢桿菌(Bacillus?natto)的納豆激酶產量不高，由此得到的納豆激酶的生產方法亦不夠理想。諸如此種種因素，是溶栓制劑的產量和質量接受影響，從而限制了它們的推廣應用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種新的從紫芝中制備溶栓酶的方法，其原料來源廣泛、制備容易。

同時本發明的目的還在于將上述紫芝溶栓酶應用于制備治療血栓栓塞性疾病的藥物中。

為了實現上述目的，本發明提供的紫芝溶栓酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟：紫芝的固態發酵過程和酶的分離純化過程，其中：

紫芝的固態發酵過程包括：①菌種活化，將紫芝菌絲體均勻涂布在斜面培養基表面培養；②種子培養，以黃豆為種子培養基，將步驟①獲得的活化菌種接種至種子培養基搖瓶培養；③將黃豆制成固體發酵培養基；④發酵產酶，將步驟②獲得的種子菌液接種至步驟③獲得的固體發酵培養基中發酵培養獲得固體發酵物料；

酶的分離純化過程包括：i粗酶制劑制備，取前述固態發酵過程中獲得的固體發酵物料加入磷酸鈉緩沖液勻漿，攪拌制備、離心，取上清液為粗酶液；ii酶的純化，將步驟i獲得的粗酶液進行Sephadex?G-50柱層析，和CMC離子交換柱層析，用離子強度pH線性梯度洗脫，收集具酶活性的洗脫液部分，獲得純化的紫芝溶栓酶。

所述紫芝固態發酵過程步驟①中的菌種活化培養基由下列物質按重量份組成：馬鈴薯180-220重量份，胡蘿卜180-220重量份，瓊脂18-22重量份，蛋白胨0.9-1.1重量份，葡萄糖18-22重量份，磷酸二氫鉀0.4-0.6重量份，硫酸鎂0.2-0.3重量份。

所述紫芝固態發酵過程步驟②中的種子培養基由下列物質按重量份組成：黃豆45-55重量份，玉米8-12重量份，蔗糖18-22重量份，硫酸鎂0.5-0.6重量份，蛋白胨3.5-4.5重量份，葡萄糖8-12重量份，磷酸二氫鉀1.4-1.6重量份，氯化鈣0.2-0.3重量份。

所述紫芝固態發酵過程步驟③的發酵培養基由下列物質按重量份組成：黃豆90-110重量份，玉米27-33重量份，蔗糖2.5-3重量份，葡萄糖2.5-3重量份，氯化鈣0.5-0.6重量份，磷酸二氫鉀0.8-1.2重量份，硫酸鎂0.5-0.6重量份，蛋白胨0.3-0.4重量份，酵母膏0.5-0.6重量份。