[發明專利]運用實時熒光PCR技術鑒定剪股穎粒線蟲的方法

無效

• 申請號: 200810025752.8
• 申請日: 2008-01-11
• 公開（公告）號: CN101419169A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發明（設計）人: 謝輝;馬以桂;王金成;黃國明
• 申請（專利權）人: 華南農業大學;天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 林麗明;任 重

技術領域

本發明涉及生物學鑒定技術，具體地說涉及一種線蟲分子生物學鑒定技術，即運用實時熒光PCR反應來鑒定粒線蟲，特別是剪股穎粒線蟲的技術。

背景技術

剪股穎粒線蟲(Anguina?agrostis)，是墊刃目(Tylenchida)、墊刃亞目(Tylenchina)、墊刃總科(Tylenchoidea)、粒線蟲科(Anguinidae)、粒線蟲屬(Anguina)中一種重要的植物線蟲，是牧草上重要的有害生物。其寄主植物主要包括剪股穎屬(Agrostisspp.)、拂子茅屬(Calamagrostis?spp.)、苔草屬(Carex?spp.)、鴨茅屬(Dactylis?spp.)、畫眉草屬(Eragrostis?spp.)、羊茅屬(Festuca?spp.)、大麥屬(Hordeum?spp.)、黑麥草屬(Lolium?spp.)、梯牧草屬(Phleum?spp.)、早熟禾屬(Poa?spp.)、堿茅屬(Puccinelliaspp.)、鼠尾粟屬(Sporobolus?spp.)、三毛草屬(Trisetum?spp.)等，主要為害寄主植物的花序，致使病株的種子和地上部產量下降。特別是在廣泛種植剪股穎等牧草的地區，對生產構成嚴重的威脅。此外，剪股穎粒線蟲還是拉氏桿菌的介體，它們協同作用在寄主穎果上形成的黃色蟲癭對動物有高度毒性，可導致牛、馬、羊等動物的神經紊亂，動物誤食后中毒，甚至暈倒，最后抽搐死亡。

剪股穎粒線蟲經我國專家進行風險分析后認為是危害十分嚴重的線蟲，被列為中國進境植物檢疫性線蟲。1997年國家動植物檢疫局發布了《關于對剪股穎粒線蟲實施檢疫措施的通知》，要求我國各進出境口岸加強對進境植物種子的審批和檢疫。此后，我國深圳、廣州、天津等口岸多次從進境草籽中截獲剪股穎粒線蟲，對整批貨物進行了退貨處理，引起了國內外貿易商及檢驗檢疫部門的高度關注。美國等國家的動植物檢疫部門要求出口商避免將含有剪股穎粒線蟲的草籽輸往中國。

鑒定剪股穎粒線蟲是我國出入境檢驗檢疫的一項重要工作，但是目前我國尚沒有剪股穎粒線蟲鑒定的標準方法，傳統的形態學和形態測量學鑒定方法是主要基于線蟲成蟲的形態學特征和形體測量數據，鑒定時間較長；且只有發現成蟲時，并結合寄主植物、分布區域等因素才能準確鑒定，但是日?？诎哆M出口草籽檢疫中通常只能發現剪股穎粒線蟲的幼蟲，因此準確鑒定剪股穎粒線蟲非常困難。國內研究的PCR擴增測序法以及本實驗室研究的PCR-RFLP法、多重PCR法，雖然也可以準確鑒定剪股穎粒線蟲，但是上述兩種方法都要有PCR擴增、凝膠電泳和凝膠成像過程，程序復雜，鑒定時間較長。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，為解決快速鑒定剪股穎粒線蟲的標準方法的問題而提供了一種運用實時熒光PCR技術鑒定剪股穎粒線蟲的方法。

本發明的技術方案是提供一種運用實時熒光PCR技術鑒定剪股穎粒線蟲的方法，包括以下步驟：

(1)設計并合成TaqMan探針序列，制備標準品質粒；

(2)制備待測樣品的DNA模板；

(3)對待測樣品DNA模板進行熒光PCR檢測；

(4)對標準品質粒進行熒光PCR檢測，與步驟(3)結果進行陽性對照，得到檢測結果。

步驟(1)所述設計并合成TaqMan探針序列包括以下步驟：

A、制備標準品的DNA模板；

B、進行PCR擴增，回收擴增產物，測序，根據擴增后基因序列和引物序列設計并合成TaqMan探針。

步驟B所述PCR擴增條件為：(1)94℃，3分鐘；(2)30個循環，其中每個循環包括94℃30秒、56℃30秒和72℃30秒三個步驟；(3)72℃5分鐘。

步驟B所述擴增后基因序列如SEQ?ID?NO：1所示，即

gtttgcctac?cggttgttta?cggccgtctt?atcatgtctt?ggctattgtagacgtatctg?atggctgttt?tcacaccgac?tgcatgtgg

步驟B所述引物序列為：

引物序列一5’-CCACATGCAGTCGGTGTGAA-3；

引物序列二5’-GTTTGCCTACCGGTTGTTTACG-3’。

步驟B所述探針序列為：

5’FAM-TCATGTCTTGGCTATTGTAGACGTATCTGA-TAMRA3’。

步驟(3)或步驟(4)所述PCR檢測的PCR反應體系中各組分構成比例如下：

成分??????????濃度?????????加樣量