[發明專利]運用實時熒光PCR技術鑒定剪股穎粒線蟲的方法

無效

• 申請號: 200810025752.8
• 申請日: 2008-01-11
• 公開（公告）號: CN101419169A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發明（設計）人: 謝輝;馬以桂;王金成;黃國明
• 申請（專利權）人: 華南農業大學;天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 林麗明;任 重

1.一種運用實時熒光PCR技術鑒定剪股穎粒線蟲的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)制備標準品的DNA模板，進行PCR擴增，回收擴增產物，測序，獲得具有如表SEQ?ID?NO：1所示序列的基因，根據所述基因和引物序列設計并合成TaqMan探針，制備標準品質粒；

所述引物序列為：

引物序列一5’-CCACATGCAGTCGGTGTGAA-3；

引物序列二5’-GTTTGCCTACCGGTTGTTTACG-3’；

所述探針序列為：

5’FAM-TCATGTCTTGGCTATTGTAGACGTATCTGA-TAMRA3’；

(2)制備待測樣品的DNA模板；

(3)對待測樣品DNA模板進行熒光PCR檢測；

(4)對標準品質粒進行熒光PCR檢測，與步驟(3)結果進行陽性對照，得到檢測結果。

2.根據權利要求1所述運用實時熒光PCR技術鑒定剪股穎粒線蟲的方法，其特征在于步驟(1)所述PCR擴增條件為：(1)94℃，3分鐘；(2)30個循環，其中每個循環包括94℃?30秒、56℃?30秒和72℃?30秒三個步驟；(3)72℃?5分鐘。

3.根據權利要求1所述運用實時熒光PCR技術鑒定剪股穎粒線蟲的方法，其特征在于步驟(3)或步驟(4)所述PCR檢測的PCR反應體系中各組分構成比例如下：

成分?????????濃度????????加樣量

DNA樣品??????????????????1μL；

PCR?buffer???10倍????????1μL；

MgCl2????????25mM????????0.5μL；

dNTP?????????10mM????????0.2μL；

引物序列一???20μmol/L???0.2μL；

引物序列二???20μmol/L???0.2μL；

探針序列?????20μmol/L???0.1μL；

Taq酶????????5U/μl??????0.1μL；

雙蒸水???????????????????6.7μL；

總體積???????????????????10μL；

其中DNA樣品為標準品質粒或待測樣品的DNA模板。

4.根據權利要求1所述運用實時熒光PCR技術鑒定剪股穎粒線蟲的方法，其特征在于步驟(3)或步驟(4)所述PCR檢測擴增程序為：

(1)94℃?3分鐘；

(2)94℃?10秒；

(3)60℃?30秒；

(4)回到程序(2)，重復45次。