[發(fā)明專利]結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810025747.7
• 申請(qǐng)日: 2008-01-10
• 公開（公告）號(hào): CN101481700A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏坤;佟順剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/60
• 分類號(hào): C12N15/60;C12N15/31;C12N15/52;C12N15/70;C07K14/405
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 劉 媖

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及新型的結(jié)合藻紅膽素(PEB)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。

技術(shù)背景

藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡(jiǎn)稱CPE)、藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡(jiǎn)稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡(jiǎn)稱CPC)和變?cè)逅{(lán)蛋白(allophycocyanin，簡(jiǎn)稱APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亞基，每個(gè)亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650～660nm的可見光，發(fā)射約660～670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡(jiǎn)稱PEB)；PEC的alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡(jiǎn)稱PVB)；PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin，簡(jiǎn)稱PCB)；CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。

PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley?AJ，Glazer?AN.Biosynthesis?of?thecyanobacterial?light-harvesting?polypeptide?phycoerythrocyanin?holo-alpha?subunit?in?a?heterologous?host.JBacteriol.2002；184(17)：4666～4671)。與前人的方法不同，我們發(fā)現(xiàn)Anabaena?sp.PCC7120中alr0617基因編碼beta裂合酶，在其它藍(lán)藻中也存在同源的beta裂合酶。這類beta裂合酶不僅能催化藻藍(lán)膽素PCB與PEC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的84位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價(jià)結(jié)合生成藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，還能催化藻紅膽素PEB與PEC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的84位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價(jià)結(jié)合生成一種新型的結(jié)合了PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。藻紅膽素PEB可由HO1、PebA、PebB協(xié)同催化生成(Alvey，R.M.，Karty，J.A.etc.Lesions?in?Phycoerythrin?ChromophoreBiosynthesis?in?Fremyella?diplosiphon?Reveal?Coordinated?Light?Regulation?of?Apoprotein?and?PigmentBiosynthetic?Enzyme?Gene?Expression.Plant?Cell?15(10)，2448-2463(2003))。在絕大部分的藍(lán)藻和紅藻中，都存在有編碼CPE脫輔基蛋白、CPC脫輔基蛋白、APC脫輔基蛋白、beta裂合酶以及PEB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有異形胞的藍(lán)藻中存在PEC；隱藻中沒有藻膽體，不存在上述基因中的APC的基因。

藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。目前使用的藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)主要從藍(lán)藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法，CN1344723，2002.04.17。一種水華藍(lán)藻制備藻藍(lán)蛋白的方法，CN1563083，2005.01.12)。本方法不利用藻類作為原料，而是利用基因工程方法生產(chǎn)新型的藻紅藍(lán)蛋白。藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，這種結(jié)合PEB的新型藻紅藍(lán)蛋白，為開發(fā)新型熒光探針提供了更多的選擇。本方法為藻紅藍(lán)蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容