[發明專利]鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法

有效

• 申請號: 200810025624.3
• 申請日: 2008-01-03
• 公開（公告）號: CN101475949A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 趙開弘;周明;夏坤;佟順剛
• 申請（專利權）人: 廣州天寶頌原生物科技開發有限公司;華中科技大學
• 主分類號: C12N15/60
• 分類號: C12N15/60;C12N15/31;C12N15/52;C12N15/70;C12N15/65;C07K14/405
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司
• 代理人: 劉 媖

技術領域

本發明屬于生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及一種鏈霉親和素標記的結合PEB藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法。

技術背景

藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發射約640nm的熒光；APC吸收約650～660nm的可見光，發射約660～670nm的熒光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB)；PEC的alpha亞基結合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB)；PEC的beta亞基結合的輔基色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB)；CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。

鏈霉親和素可以跟生物素特異結合，通過鏈霉親和素-生物素系統，可以實現信號放大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統已經廣泛應用于生物學檢測和醫療檢測等領域。目前主要是通過化學交聯實現鏈霉親和素對目標的標記。

CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(Tooley?A?J，Cai?Y?A，GlazerA?N.Biosynthesis?of?a?fluorescent?cyanobacterial?C-phycocyanin?holo-alpha?subunitin?a?heterologous?host[J].Proc?Natl?Acad?Sci?USA，2001，98(19)：10560～10565)。我們發現，藻藍蛋白alpha亞基裂合酶不僅可以催化PCB與藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白結合，還能催化藻紅膽素PEB與藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白結合。通過基因工程技術，把鏈霉親和素基因和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達載體，可以在大腸桿菌內表達得到鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實現鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的連接，而不需要通過化學交聯等方法來實現鏈霉親和素標記；把藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因、PEB生物酶合成基因克隆于表達載體。利用以上表達載體，通過基因工程菌，可以直接生成鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。

藻膽蛋白類熒光蛋白質可以應用于食品、化妝品、醫藥和生物工程領域。藻藍蛋白類熒光蛋白質具有優良的熒光性質，通過直接實現鏈霉親和素和藻藍蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的連接，可用于生物學檢測以及醫療檢測領域。本發明為藻藍蛋白類色素蛋白質功能材料應用于醫藥和生物工程領域，特別是檢測領域奠定了基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法，它是應用藻藍蛋白alpha亞基裂合催化藻紅膽素(PEB)與鏈霉親和素標記的藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白共價結合，制備鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。將含有藻藍蛋白alpha亞基裂合酶基因、鏈霉親和素基因和藻藍蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因拼接的基因、藻紅膽素生物合成酶基因的表達質粒依次轉入宿主菌，得到相應的工程菌，通過這種方法得到的基因工程菌生產鏈霉親和素標記的結合PEB的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質。

本發明的技術方案是這樣的：一種鏈霉親和素標記的結合藻紅膽素的藻藍蛋白alpha亞基類熒光蛋白質的制備方法，包括下述步驟：

(1)用基因工程方法，將alpha亞基裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到alpha亞基裂合酶表達質粒；