[發明專利]一種能串聯表達和同步酸水解釋放的人甲狀旁腺素1－34肽類似物及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200810025408.9
• 申請日: 2008-04-28
• 公開（公告）號: CN101307105A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發明（設計）人: 劉景晶;鳳姣;尤科軍;劉言華;施小明;王春曉;范豪;李泰明;曹榮月;吳潔
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635;C12N15/16;C12N15/70;A61K38/29;A61P19/10
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司
• 代理人: 姚姣陽

1.一種能串連表達和同步酸水解釋放的人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多 聯體，其特征在于：所述人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯體是由人 甲狀旁腺素1-34肽類似物C端天冬氨酸（Asp）和N端脯氨酸（Pro）重 復串聯形成，其中一個類似物C端的Asp和下一個類似物N端的Pro形成 酸水解位點，在鹽酸作用下可以斷開，所述多聯體的氨基酸序列為：

Met-X_a-Asp-(?Pro-R₁-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn -Arg-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg -Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp)_n

其中X_a為含有a個氨基酸殘基的肽鏈，a為非負整數；n>1；所述X_a肽鏈 序列為

Gly-Asp-Glu-Ile-Ile-His-Leu-Thr-Asp-Phe-Asp-Val-Ser-Leu-Ala- Leu-Thr-Gln-Thr；人甲狀旁腺素1-34肽類似物的氨基酸序列為：

Pro-R₁-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Arg-Gly-Lys-

His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu- Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Pro-Pro-Asp

其中R₁為Pro。

2.根據權利要求1所述一種能串連表達和同步酸水解釋放的人甲狀旁腺素 1-34肽類似物的多聯體，其特征在于：n=8。

3.根據權利要求1所述一種能串連表達和同步酸水解釋放的人甲狀旁腺素 1-34肽類似物的多聯體的制備方法，包括重組質粒以及相應的基因工 程菌的構建步驟，人甲狀旁腺素1-34肽類似物的多聯體的制備步 驟，其特征在于：在重組質粒以及相應的基因工程菌的構建步驟中， 質粒pET28a為表達載體質粒，質粒pED-Pro-Pro-［Arg¹¹］］hPTH(1-3 4)-Pro-Pro為模板，是通過PCR反應獲得含有人甲狀旁腺素1-34肽類似 物基因的DNA片段的擴增序列，引物的核苷酸序列為：

P1:?5′ATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT3′

P2:?5′CCGCAAGCTTAATCTGGCGGGAAGTTATGAACA3′

P3:?5′AAAAGATCTGGCGGGAAGTTATGAACATC3′

P4:

5′AGATATACATGGGCGATGAAATCATCCACCTGACTGACTTCGATGTTTCTCTG

GCTCTG3′

P5:

5′CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATGGGCGATG

AAA3′。

4.根據權利要求3所述一種能串連表達和同步酸水解釋放的人甲狀旁腺素 1-34肽類似物的多聯體的制備方法，其特征在于：在人甲狀旁腺素1- 34肽類似物的多聯體制備步驟中，將重組基因工程菌BL21/pED-8PTH′ 經發酵-離心-洗滌沉淀-乙醇沉淀得到多聯體粗品，其中發酵溫度是3 6-38℃，pH6.8-7.2。