[發明專利]一種人分化抑制因子3表達載體、融合蛋白及其制備方法

無效

• 申請號: 200810025405.5
• 申請日: 2008-04-30
• 公開（公告）號: CN101275147A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 李曉軍;賈麗;仲愛芳;虞偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南京軍區南京總醫院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/12;C07K19/00;C07K16/18
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司
• 代理人: 夏平;劉成群

1、一種人分化抑制因子3的表達載體，其特征是將PCR擴增后的hId3基因克隆于融合表達載體pET32a的EcoR?I和Sal?I位點之間，得到重組表達載體hId3/pET32a，其中hId3基因上游融合了6個組氨酸和硫氧還原蛋白基因片段，利用His標簽與Ni離子的親和作用，融合表達出的蛋白產物用Ni-NAT樹脂進一步純化，hId3與Trx的融合表達增加表達產物的可溶性，攜帶Trx-His-hId3融合基因的hId3/pET32a處于pET32a的T7啟動子控制之下，融合蛋白基因中的外源蛋白基因與Trx之間還具有腸激酶和凝血酶的識別位點，便于從融合蛋白中切下Trx。

2、一種人分化抑制因子3融合蛋白，其特征是該融合蛋白是采用權利要求1所述的表達載體轉化大腸桿菌BL21進行表達并純化得到的。

3、根據權利要求2人分化抑制因子3融合蛋白，其特征是該融合蛋白通過下列方法制備得到：用權利要求1所構建的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21，在37℃進行基礎培養，當細菌密度OD₆₀₀值為0.4～0.6時，37℃表達3～4小時；收集表達細胞，懸浮于1×Binding?Buffer(20mM?Tris-HCl，pH?7.9，500mM?NaCl，10mMβ-巰基乙醇，1mmol/L?PMSF)，超聲破碎細胞，經離心后，取上清液用于Ni-NTA親和層析柱分離純化，獲得融合蛋白Trx-His-hId3。

4、根據權利要求2或3所述的人分化抑制因子3融合蛋白的制備方法，其特征在于包括下列步驟：

用權利要求1所述的重組表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，在37℃進行基礎培養，當細菌密度OD₆₀₀值為0.4～0.6時，37℃表達4小時；收集表達細胞，懸浮于1×Binding?Buffer(20mM?Tris-HCl，pH?7.9，500mM?NaCl，10mMβ-巰基乙醇，1mmol/LPMSF)，超聲破碎細胞，經離心后，取上清液用于Ni-NTA親和層析柱分離純化，獲得融合蛋白Trx-His-hId3。

5、根據權利要求4所述的人分化抑制因子3融合蛋白的制備方法，其特征在于在純化過程中，Washing?buffer?I為：20mM?Tris-HCl，pH?7.9，500mM?NaCl，10mMβ-巰基乙醇，30mmol/L咪唑；Washing?Buffer?II為：20mM?Tris-HCl，pH?7.9，500mM?NaCl，10mMβ-巰基乙醇，45mmol/L咪唑。

6、一種抗hId3多克隆抗體，其特征在于它是兔源性的多克隆抗體，用凝血酶切割權利要求2或3所述的融合蛋白Trx-His-hId3，用Ni-NTA親和層析柱再次分離，獲得切下Trx-His的hId3蛋白，以此蛋白為抗原作為免疫抗原，免疫具有免疫活性的新西蘭白兔而得到。

7.如權利要求6所述的抗hId3多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的免疫過程為用凝血酶切割權利要求2或3所述的融合蛋白Trx-His-hId3，用Ni-NTA親和層析柱再次分離，獲得切下Trx-His的hId3蛋白，以此重組蛋白為免疫抗原，免疫8周齡新西蘭雄兔，背部皮下分多點注射；首次免疫時，用純化的重組蛋白1mg與1ml弗氏完全佐劑充分乳化，于每只兔子背部皮內注射；15天后，加強免疫，劑量同上但用弗氏不完全佐劑，注射于背部皮下；兩周后使用加強免疫的方法再次加強免疫；第二次加強免疫10天后，開始取耳緣靜脈采血檢測抗體效價，用瓊脂糖單向擴散試驗測得兔源性抗血清的效價，收集抗血清，分裝，于-70℃凍存。