[發明專利]利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法

無效

• 申請號: 200810024846.3
• 申請日: 2008-05-07
• 公開（公告）號: CN101281201A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發明（設計）人: 王強;陳建群;張云華;張鵬飛;王凱;劉靜;王海燕;李宕
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N1/28
• 代理公司: 南京天翼專利代理有限責任公司
• 代理人: 湯志武;王鵬翔

技術領域

本發明涉及一種制備方蛋白質分子量標準的方法，可用于生物科學和生物方法等領域。

背景技術

1、內含肽介導的反式剪接原理

蛋白質內含肽(intein)是寄生在其它蛋白質中的一段多肽鏈。其編碼DNA序列與正常蛋白的外顯子一起轉錄和翻譯，產生一條多肽鏈。然后從中切除與內含肽對應的序列，再把被寄生蛋白質的序列連接起來，成為有功能的蛋白質。這是一種蛋白質的自我剪接機制。一般來說，蛋白質內含肽有10個模體(motif)，順序依次為N□?AN₂BN₄CDEHFG?C□，其中A、N₂、B、N₄、F、G屬于自我剪接域的模體，而C、D、E、H屬于歸位核酸內切酶域的模體(Perler?FB，Olsen?GJ，AdamE.Compilation?and?analysis?of?intein?sequences.Nucleic?Acids?Res.1997，25(6)：1087；Perler?FB.InBase：the?Intein?Database.Nucleic?Acids?Res.2002，30(1)：383)。對于內含肽行使剪接功能來說，歸位核酸內切酶結構域并不是必須的。

藍藻Synechocystis?sp.PCC6803的DNA聚合酶III的α亞基(DnaE)，分成兩段，dnaE-n基因編碼前774個氨基酸，dnaE-c基因編碼后423個氨基酸，這兩段間隔745kb。它們分別表達后，通過內含肽的相互識別，反式剪接到一起形成完整功能蛋白(見圖1)。(Sun?W，Yang?J，Liu?XQ.Synthetic?two-piece?and?three-piece?split?inteins?for?protein?trans-splicing.J?BiolChem.2004，279(34)：35281)。

2、蛋白質分子量標準的重要性

蛋白質研究是生命科學中重要的組成部分，其中蛋白質分子量標準作為蛋白質的定性甚至定量研究的重要工具，可用于蛋白質電泳、蛋白質定量以及蛋白質印跡等。目前，蛋白質分子標準的來源較窄，尤其是高分子量蛋白質標準。目前市面上的眾多蛋白質分子量標準多是采用的已知天然蛋白，分子量數值關系不是等比例(見表1)，實驗觀察時不是很明了。如果待檢測蛋白分子量恰好在兩個跨度較大的蛋白之間，那么檢測不出來。

有些大型生物公司通過直接表達特定的重組蛋白來獲得整數大小分子量標準，但這種方法導致生產成本極高，如Invitrogen公司的BenchMark?Protein?Ladder，每毫升價格為2600元。

利用內含肽的反式剪接方法，可以將不同分子量的蛋白質連接在一起，制作間隔均勻的蛋白質分子量標準。

發明內容

本發明目的是：利用內含肽的反式剪接方法，將不同分子量的蛋白質連接在一起，制作間隔均勻的蛋白質分子量標準。

利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，選擇一段在一定分子量間蛋白X，另選擇兩種互不兼容的內含肽A和B，將內含肽A和B分別分解為氨基末端(N端)與羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc；然后將它們組成五個重組蛋白，即起點(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)、中段2(Bc-X-An)、終點1(Ac-X)、終點2(Bc-X)；通過上面五個蛋白的相互組合疊加，獲得多種分子量分布范圍的蛋白質分子量標準；該核酸分子編碼的蛋白包含已知蛋白和斷裂內含肽A的氨基末端部分。這一段特定分子量蛋白X(如10kD)，兩種互不兼容的內含肽A和B(如藍藻Synechocystis?sp.PCC6803的DnaE和DnaB)，將內含肽A和B分別分解為氨基末端(N端)與羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc。然后將它們組成五個重組蛋白，即起點(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)、中段2(Bc-X-An)、終點1(Ac-X)、終點2(Bc-X)。經研究發現，幾乎所有的內含肽基因都可以在歸位核酸內切酶編碼區被分割成兩部分，這兩個部分分別表達，再通過內含肽相互識別，重新組裝激活剪接活性，使兩端的蛋白連接起來。

一定分子量間的蛋白X，如10kD，也可以在幾十至上百kD。

具體定義如下：

起點：已知分子量的蛋白和斷裂內含肽A的氨基部分(N端)相連的蛋白；

中段1：已知分子量的蛋白一端連接斷裂內含肽A的羧基部分(C端)，另一端連接斷裂內含肽B的氨基部分(N端)；