[發(fā)明專利]利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810024846.3
• 申請日: 2008-05-07
• 公開（公告）號: CN101281201A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發(fā)明（設計）人: 王強;陳建群;張云華;張鵬飛;王凱;劉靜;王海燕;李宕
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N1/28
• 代理公司: 南京天翼專利代理有限責任公司
• 代理人: 湯志武;王鵬翔

1、利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，其特征是選擇一段一定分子量的已知蛋白X，另選擇兩種互不兼容的內含肽A和B，將內含肽A和B分別分解為氨基末端(N端)與羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc；然后將它們組成五個重組蛋白，即起點蛋白(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)蛋白、中段2蛋白(Bc-X-An)、終點1蛋白(Ac-X)、終點2蛋白(Bc-X)；通過上面五個蛋白的相互組合連接疊加，獲得多種分子量分布范圍的蛋白質分子量標準。

2、根據(jù)權利要求1所述的利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，其特征是五種非天然形成的蛋白分子構成：

1)一種蛋白包含一定分子量的已知蛋白和斷裂內含肽A的氨基末端部分；

2)一種蛋白包含斷裂內含肽A的羧基末端部分，一定分子量的已知蛋白和斷裂內含肽B的氨基末端部分；

3)一種蛋白包含斷裂內含肽B的羧基末端部分，一定分子量的已知蛋白和斷裂內含肽A的氨基末端部分；

4)一種蛋白包含斷裂內含肽A的羧基末端部分和一定分子量的已知蛋白；

5)一種蛋白包含斷裂內含肽B的羧基末端部分和一定分子量的已知蛋白。

3、根據(jù)權利要求1所述的利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，其特征是：

1)編碼“起點”蛋白的核苷酸序列，該核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的3′端側接編碼斷裂內含肽A的氨基末端部分的核苷酸序列；

2)編碼“中段1”蛋白的核苷酸序列，該核酸分子由已知蛋白的核苷酸序列的5′端側接編碼斷裂內含肽A的羧基末端部分的核苷酸序列，3′端側接編碼斷裂內含肽B的氨基末端部分的核苷酸序列；

3)編碼“中段2”蛋白的核苷酸序列，該核酸分子由已知蛋白的核苷酸序列的5′端側接編碼斷裂內含肽B的羧基末端部分的核苷酸序列，3′端側接編碼斷裂內含肽A的氨基末端部分的核苷酸序列；

4)編碼“終點1”蛋白的核苷酸序列，該核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的5′端側接編碼斷裂內含肽B的羧基末端部分的核苷酸序列；

5)編碼“終點2”蛋白的核苷酸序列，該核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的5′端側接編碼斷裂內含肽A的羧基末端部分的核苷酸序列。

4、根據(jù)權利要求1所述的利用內含肽反式剪接制作蛋白質分子量標準的方法，其特征是選擇大腸桿菌Escherichia?coli?K12的gusA基因的1-85氨基酸，加上一個天冬氨酸(密碼子為GAU)，得到分子量為10000.23Da的蛋白序列，作為蛋白X；另選擇藍藻Synechocystis?sp.PCC6803的DnaE和DnaB分別作為內含肽A和B。將內含肽A和B分別分解為氨基末端(N端)與羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc。然后將它們組成五個重組蛋白，即起點(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)、中段2(Bc-X-An)、終點1(Ac-X)、終點2(Bc-X)；

首先讓“起點”蛋白和“終點2”蛋白反應，得到分子量為已知蛋白兩倍的蛋白；

讓“起點”蛋白、“中段2”蛋白反應，然后再加入“終點1”蛋白反應，得到分子量為已知蛋白3倍的蛋白；讓“起點”蛋白、“中段1”蛋白反應，然后再加入“中段2”蛋白反應，最后加入“終點2”蛋白，得到分子量為已知蛋白4倍的蛋白；依次循環(huán)重復，便可以得到分子量為已知蛋白任意整數(shù)倍的蛋白。