[發(fā)明專利]起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810023782.5
• 申請(qǐng)日: 2008-04-18
• 公開（公告）號(hào): CN101265484A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊向軍;周亞峰;李紅霞;韓蓮花;蔣文平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/86
• 分類號(hào): C12N15/86;C12N15/12;A61K48/00;A61P9/06
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司
• 代理人: 范晴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

哺乳動(dòng)物基因組編碼四種HCN基因，分別命名為HCN1～HCN4。這四種異構(gòu)體在心臟中均已發(fā)現(xiàn)，但不同種屬、不同心臟組織和發(fā)育不同階段這些異構(gòu)體的表達(dá)存在差異：不同種屬成年動(dòng)物竇房結(jié)均優(yōu)勢(shì)表達(dá)HCN4，約占竇房結(jié)總體HCN的80％。在四種異構(gòu)體中HCN1，2，4是心臟中的主要部分，HCN3只在胚胎起搏細(xì)胞中有低水平表達(dá)。起搏活性小的區(qū)域(如心室肌)，HCN2的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)；而起搏活性高的區(qū)域HCN4的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)。目前對(duì)于生物起搏的研究集中于HCN2和HCN4。

目前的研究大多使用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)來初步探討生物起搏的可行性；雖然此類研究也獲得了較大的成就，但由于腺病毒表達(dá)系統(tǒng)具有高免疫原性，其病毒基因組游離于宿主基因組外，所以只能瞬時(shí)表達(dá)外源基因，國(guó)外體內(nèi)的研究?jī)H僅持續(xù)了3-10天，這就限制了它的發(fā)展。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，但也有不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的組份和特性，該病毒既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性，這是其最為突出的優(yōu)點(diǎn)。可見慢病毒可能是基因治療的最佳載體，以后的發(fā)展趨勢(shì)也許是利用慢病毒為載體，結(jié)合細(xì)胞治療和基因治療；把起搏基因HCN1-4轉(zhuǎn)到干細(xì)胞中，增加起搏細(xì)胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。而構(gòu)建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN2與慢病毒一起建立HCN2重組病毒載體，成為慢性心律失常的細(xì)胞治療和基因治療的基礎(chǔ)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒。

本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案是：一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒；

所述穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN2的構(gòu)建方法包括以下步驟：

(1)將目的片段HCN2基因從pcDNA3-HCN2中切下，連接入Puc19質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒Puc19-HCN2

(2)將目的片段HCN2基因從質(zhì)粒Puc19-HCN2中切下，連接入pcDNA3.1A質(zhì)粒中，構(gòu)建質(zhì)粒pCDNA3.1A-HCN2；

(3)將目的片段HCN2基因從pcDNA3.1A-HCN2中切下，連接入pCDH1-MCS1-EF1-copGFP質(zhì)粒中，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN2。

所述構(gòu)建方法還包括將穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN2與慢病毒系統(tǒng)混合重組后的HCN2慢病毒載體包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得病毒液。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是：慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，其既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因并具有較低的免疫原性。構(gòu)建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎(chǔ)。如果把帶有起搏基因HCN2的片段重組到慢病毒中，進(jìn)而再轉(zhuǎn)到干細(xì)胞中，可以增加起搏細(xì)胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。

附圖說明

圖1為慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒圖譜；

圖2為轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24小時(shí)后的熒光照片(放大倍數(shù)250×)；

圖3為Western?blot蛋白電泳圖，轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染細(xì)胞；空：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

圖4為HCN2?real-time?RT-PCR實(shí)時(shí)定量檢測(cè)結(jié)果曲線；

圖5為HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染流程示意圖；

圖6a為本發(fā)明陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的測(cè)序報(bào)告第一部分；

圖6b為本發(fā)明續(xù)圖6a的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序報(bào)告的第二部分。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例：一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質(zhì)粒與病毒系統(tǒng)一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質(zhì)粒為pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒；