[發(fā)明專利]痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 200810023287.4 | 申請日： | 2008-04-01 |
| 公開（公告）號： | CN101265498A | 公開（公告）日： | 2008-09-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王惠民;孫寶蘭;朱俐;丁偉峰;景蓉蓉;褚少朋 | 申請（專利權(quán)）人： | 南通大學附屬醫(yī)院 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 南通市永通專利事務所 | 代理人： | 葛雷 |
| 地址： | 226001*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 增殖 誘導 mrna 定量 測定 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種痰中增殖誘導配體mRNA測定方法。
背景技術(shù)：
肺癌嚴重威脅人類的健康和生命，是人類致死的主要病因之一，且 發(fā)病率逐年增多。研究表明，肺癌的發(fā)生與基因表達變化有關(guān)，基因改 變可涉及癌變的初始發(fā)生和后續(xù)發(fā)展。增殖誘導配體(a proliferation-inducing?ligand，APRIL)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis?factor，TNF)超家族中的一員，1998年首先由Hahne等發(fā)現(xiàn)并 克隆成功。APRIL在正常組織僅有少量表達，而在腫瘤特別是消化道腫瘤 (包括直腸、結(jié)腸、十二指腸)中呈高表達。已有研究證實，APRIL與腫 瘤的生長調(diào)節(jié)密切相關(guān)，在體內(nèi)和體外均能刺激腫瘤細胞生長。
發(fā)明內(nèi)容：
本發(fā)明的目的在于提供一種準確可靠，作為肺癌發(fā)生的檢測指標的 痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：
一種痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法，其特征是：包括下 列步驟：
(1)引物合成：依據(jù)Genebank收錄人APRIL?mRNA和β2微球蛋 白mRNA，用Primer?Premier?5.0軟件設(shè)計引物，其中APRIL和β2M引 物跨內(nèi)含子，APRIL下游引物跨越327bp的第1個內(nèi)含子，β2M上游引 物跨越3811bp的第1個內(nèi)含子；APRIL上游引物：5’-ACT?CTC?AGT?TGC CCT?CTG?GTT?G-3’(819nt～840nt)，APRIL下游引物：5’-GGA?ACT?CTG CTC?CGG?GAG?ACT?C-3’(984nt～1005nt)，擴增片段長度187bp；β2M 上游引物：5’-CTA?TCC?AGC?GTA?CTC?CAA-3’(119nt～136nt)，β2M 下游引物：5’-GCA?GGC?ATA?CTC?ATC?TTT?T-3’(342nt～360nt)，擴 增片段長度242bp；
(2)APRIL定量質(zhì)粒標準品及β2M定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建：
a)標本收集及預處理：收集對象晨起用清水漱口后，咳深部痰2～ 3口于無菌痰盒內(nèi)，用力振蕩，混勻。痰內(nèi)加入適量0.1％二硫蘇糖醇 解粘，振蕩液化10～20min至痰中無粘稠痰塊呈均勻液相后，用70μm尼 龍篩網(wǎng)過濾至10ml消毒玻璃管內(nèi)，4℃1200rpm離心8min，棄上清，管 底沉淀物用1×磷酸鹽緩沖液(PBS液)洗2遍，再用1×PBS液重懸， 制成細胞懸液，鏡下計數(shù)細胞，調(diào)細胞懸液濃度至1×106/mL，-70℃ 冰凍保存，留作RNA提取用；
b)總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄：取預處理后痰標本細胞懸液0.8mL加 1mLTrizol提取總RNA，取總RNA?0.8μg，以特異性抓尾引物Oligo(DT)18為引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分裝后-20℃保存；
c)APRIL定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建：取上述cDNA?2μl用APRIL上、 下游引物于PTC-200PCR循環(huán)儀進行PCR擴增，反應條件為：94℃3min， 94℃30s、62℃40s、72℃30s，33個循環(huán)，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物 用膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與pGEM-T?easy載體4℃連接12～16h， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于經(jīng)2％X-gal和20％IPTG 處理的含75μg/ml氨芐青霉素的LB平皿上，37℃倒置培養(yǎng)12～16h， 經(jīng)藍白斑篩選，白色菌落經(jīng)PCR初步鑒定后，陽性克隆進行測序分析， 將篩選出的陽性菌株擴增，抽提質(zhì)粒，用核酸蛋白分析儀準確定量，并 進行10倍系列稀釋作為標準品，分裝后-20℃保存；
d)β2M定量質(zhì)粒標準品的構(gòu)建：取上述cDNA?2μl，以β2M上、 下游引物于PTC-200PCR循環(huán)儀擴增目的片段，其余步驟同APRIL定量 質(zhì)粒標準品的構(gòu)建，得到10倍系列稀釋β2M定量質(zhì)粒標準品，分裝后 -20℃保存；
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