[發明專利]痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法

無效

• 申請號: 200810023287.4
• 申請日: 2008-04-01
• 公開（公告）號: CN101265498A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 王惠民;孫寶蘭;朱俐;丁偉峰;景蓉蓉;褚少朋
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南通市永通專利事務所
• 代理人: 葛雷

1、一種痰中增殖誘導配體mRNA定量測定方法，其特征是：包括 下列步驟：

(1)引物合成：依據Genebank收錄人APRIL?mRNA和β₂微球蛋 白mRNA，用Primer?Premier?5.0軟件設計引物，其中APRIL和β₂M引 物跨內含子，APRIL下游引物跨越327bp的第1個內含子，β₂M上游引 物跨越3811bp的第1個內含子；APRIL上游引物：5’-ACT?CTC?AGT?TGC CCT?CTG?GTT?G-3’(819nt～840nt)，APRIL下游引物：5’-GGA?ACT?CTG CTC?CGG?GAG?ACT?C-3’(984nt～1005nt)，擴增片段長度187bp；β₂M 上游引物：5’-CTA?TCC?AGC?GTA?CTC?CAA-3’(119nt～136nt)，β₂M 下游引物：5’-GCA?GGC?ATA?CTC?ATC?TTT?T-3’(342nt～360nt)，擴 增片段長度242bp；

(2)APRIL定量質粒標準品及β₂M定量質粒標準品的構建：

a)標本收集及預處理：收集對象晨起用清水漱口后，咳深部痰2～ 3口于無菌痰盒內，用力振蕩，混勻。痰內加入適量0.1％二硫蘇糖醇 解粘，振蕩液化10～20min至痰中無粘稠痰塊呈均勻液相后，用70μm尼 龍篩網過濾至10ml消毒玻璃管內，4℃1200rpm離心8min，棄上清，管 底沉淀物用1×磷酸鹽緩沖液(PBS液)洗2遍，再用1×PBS液重懸， 制成細胞懸液，鏡下計數細胞，調細胞懸液濃度至1×10⁶/mL，-70℃ 冰凍保存，留作RNA提取用；

b)總RNA提取和逆轉錄：取預處理后痰標本細胞懸液0.8mL加 1mLTrizol提取總RNA，取總RNA?0.8μg，以特異性抓尾引物Oligo(DT)₁₈為引物逆轉錄為cDNA，分裝后-20℃保存；

c)APRIL定量質粒標準品的構建：取上述cDNA?2μl用APRIL上、 下游引物于PTC-200PCR循環儀進行PCR擴增，反應條件為：94℃3min， 94℃30s、62℃40s、72℃30s，33個循環，72℃延伸5min。PCR產物 用膠回收試劑盒回收，回收產物與pGEM-T?easy載體4℃連接12～16h， 將連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，涂布于經2％X-gal和20％IPTG 處理的含75μg/ml氨芐青霉素的LB平皿上，37℃倒置培養12～16h， 經藍白斑篩選，白色菌落經PCR初步鑒定后，陽性克隆進行測序分析， 將篩選出的陽性菌株擴增，抽提質粒，用核酸蛋白分析儀準確定量，并 進行10倍系列稀釋作為標準品，分裝后-20℃保存；

d)β₂M定量質粒標準品的構建：取上述cDNA?2μl，以β₂M上、 下游引物于PTC-200PCR循環儀擴增目的片段，其余步驟同APRIL定量 質粒標準品的構建，得到10倍系列稀釋β₂M定量質粒標準品，分裝后 -20℃保存；

(3)痰中APRIL?mRNA含量測定：將待測痰液用與步驟(2)相同 的標本收集及預處理、總RNA提取和逆轉錄方法合成cDNA；將其中 2μlcDNA模板加入18μl?PCR反應液，所述PCR反應液中含1×PCR buffer，4.0mmol/L?MgCl₂，0.2mmol/L?dNTPs，APRIL上、下游引物各 0.15μmol/L，20×SYBR?Green?I?0.3μl，Taq?DNA聚合酶1.5U；混勻 后加入Roche專用毛細管中，并設立以水作模板的空白對照、以空載質 粒作模板的陰性對照和相應的6個濃度分別為10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、 10⁴copies/ml的質粒標準品，各反應管于Roche熒光定量檢測儀進行 APRIL?PCR擴增，擴增參數為：94℃預變性3min；94℃5s，62℃35s， 86℃1s讀取熒光度值，40個循環，測出待測樣本中APRIL準確含量； 另將2μlcDNA模板加入18μl?PCR反應液，所述PCR反應液中含1×PCR buffer，4.0mmol/L?MgCl₂，0.2mmol/L?dNTPs，β₂M上、下游引物各 0.15μmol/L，20×SYBR?Green?I?0.3μl，Taq?DNA聚合酶1.5U；混勻 后加入Roche專用毛細管中，并設立以水作模板的空白對照、以空載質 粒作模板的陰性對照和相應的6個濃度分別為10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、 10⁴copies/ml的質粒標準品，各反應管于Roche熒光定量檢測儀進行 β₂M?PCR擴增，擴增參數為：94℃預變性3min；94℃5s，60℃35s， 81℃1s讀取熒光度值，40個循環；測出待測樣本中β₂M準確含量。