[發明專利]一種雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物及其用法

無效

• 申請號: 200810022441.6
• 申請日: 2008-07-21
• 公開（公告）號: CN101348830A
• 公開（公告）日: 2009-01-21
• 發明（設計）人: 李火根;張紅蓮;胥猛;馮源恒
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所
• 代理人: 柏尚春

技術領域

本發明涉及雜交鵝掌楸的分子檢測引物及其用法，專用于鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸快速分子檢測和鑒定，屬于植物新品種鑒定領域。

背景技術

木蘭科鵝掌楸屬(Liriodendron)植物現存2個種，一種是北美鵝掌楸(L.tulipiferaLinn.)；另一種為鵝掌楸〔L.chinense(Hemsl.)Sarg.〕。鵝掌楸生長迅速，樹干圓滿通直，材質優良，病蟲害很少，葉形奇特，花冠色澤淡雅，具有較高的觀賞價值，因此，鵝掌楸是優良的園林綠化與工業用材樹種(王章榮，等.鵝掌楸屬樹種雜交育種與利用[M].北京：中國林業出版社，2005)。

自1963年我國已故著名林木遺傳育種學家葉培忠教授成功獲得雜交鵝掌楸以來，南京林業大學先后培育出一批雜交鵝掌楸優良家系與無性系，經過40余年的試驗研究，證實了雜交鵝掌楸具有非常強的雜種優勢。與2個親本種鵝掌楸與北美鵝掌楸相比，雜交鵝掌楸表現出速生、花色艷麗、葉大、抗逆性強、適應性廣、幾乎無病蟲害等優勢，是優良的園林綠化及珍貴用材樹種。迄今為止，雜交鵝掌楸已在江蘇、福建、湖南、浙江、江西、山東、湖北、湖南、貴州、云南、北京等地區推廣，產生了巨大的經濟和社會效益。2007年，因其葉形似中國傳統服裝馬褂以及雜交鵝掌楸速生、觀賞性好、適應性廣等優點而被列為2008年北京奧運會的奧運樹。

隨著人們對雜交鵝掌楸利用價值的不斷認識，其推廣應用規模迅速擴大，導致其苗木供不應求，苗木價格不斷攀升。為追逐利益的最大化，許多不法苗木經營商常將鵝掌楸或北美鵝掌楸苗木假冒雜交鵝掌楸苗木出售，造成雜交鵝掌楸苗木市場的混亂，無形中傷害了正規苗木生產者與經營商的積極性，必將阻礙雜交鵝掌楸的推廣和發展。因此，生產上急需一種方便、快速、可靠的雜交鵝掌楸鑒別方法。

傳統的鵝掌楸種類鑒定基于形態特征(劉洪諤，沈湘林，曾玉亮.，中國鵝掌楸、美國鵝掌楸及其雜種在形態和生長形狀上的遺傳和變異，浙江林業科技，1991，11(5)：18～22)、解剖特征(葉金山，周守標，王章榮.雜種鵝掌楸葉解剖結構特征的識別.植物資源與環境，1997，6(4)：58～60)和同工酶譜帶(黃敏仁，陳道明，雜種馬褂木的同工酶分析，南京林產工業學院學報，1979，1(2)：156～158)等方面。但形態特征在苗期差異并不明顯且受環境因素影響較大、同工酶標記也受基因表達的限制而影響其使用。

基于檢測DNA水平多態性的分子標記技術的發展為雜種識別和親本選配提供了有效的途徑。李周岐、王章榮采用RAPD分子標記技術，對雜種鵝掌楸識別方法進行了探討(李周岐，王章榮.用RAPD標記進行鵝掌楸雜種識別和親本選配.林業科學，2002，38(5)：169～174)，利用RAPD指紋圖譜進行雜種馬褂木無性系鑒定(李周岐，王章榮.雜種馬褂木無性系隨機擴增多態DNA指紋圖譜的構建.東北林業大學學報，2001，29(4)：5-8)。但基于RAPD技術的分子檢測與品種鑒定存在以下主要缺陷：(1)RAPD的檢測受反應條件的影響較大，其重復性和穩定性差，從而嚴重影響檢測結果的可信度。(2)需要使用多對引物，操作煩瑣，耗時長，不能達到快速、準確鑒定的目標。

發明內容

本發明的目的是克服以往雜交鵝掌楸鑒定方法存在的缺陷，提供結果高度準確可靠、易于操作、靈敏度高的雜交鵝掌楸的檢測和診斷方法。該方法可以直接應用于生產實踐，對于雜交鵝掌楸苗木的鑒定和交易無疑具有十分重要的意義。

為達到上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

一種雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物，包括鵝掌楸特異性SSR引物對LT008L/R，其引物序列為：

LT008L????CCGAACGATGATAAAGTGAG

LT008R????GTAGGTTTGAAGGGAAGAGG

上述LT008L和LT008R引物對在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產物，在雜交鵝掌楸中特異性擴增出180bp和190bp雙帶位的產物。

上述雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物的用法，包括：

DNA提取采用改進的CTAB裂解-硅珠吸附法，按照如下的PCR反應體系和反應程序用引物對LT008L和LT008R對鵝掌楸的樣本進行PCR擴增；