[發明專利]黃瓜游離小孢子的培養方法

無效

• 申請號: 200810022098.5
• 申請日: 2008-07-18
• 公開（公告）號: CN101317548A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 陳勁楓;詹艷;錢春桃;婁群峰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01H1/08;A01H1/04;C12N3/00;C12N5/04
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 張素卿

技術領域

本發明是黃瓜游離小孢子的培養方法，涉及黃瓜小孢子游離、純化及懸浮液制備和游離小孢子培養方法，屬于生物技術科學領域。

背景技術

單倍體是指僅攜有配子染色體數目的個體，在作物育種實踐和遺傳育種理論研究中均具有重要意義。單倍體經染色體加倍即可獲得純合的雙單倍體。在育種實踐中，對單倍體進行染色體加倍當代就可以獲得純系即雙單倍體群體，而利用常規育種手段培育自交系需要6～7年，甚至更長的時間。同時，雙單倍體是絕對純合的，基因型與表現型完全一致，而通過高代自交獲得的自交系仍會有少數位點是雜合的。因此，利用單倍體或雙單倍體進行新品種選育和品種改良可以大大縮短育種周期，提高選擇效率。在遺傳育種理論研究中，雙單倍體在遺傳上具有絕對的純合性，是進行AFLP、RFLP和RAPD等分子標記和遺傳圖譜繪制研究的良好材料，也是進行物種進化研究、遺傳分析和植物基因克隆篩選的理想材料。此外，從一些特殊材料中誘導獲得的單倍體具有特異的染色體組成，如單體、三體和易位系等。譬如對遠緣雜交種F₁進行花粉培養可以得到異源附加系、代換系和異位系等。這些材料都是非常好的染色體工程材料。

單倍體材料的獲得途徑包括自然發生單倍體及人工誘導單倍體。前者發生頻率極低，難以應用。目前人工誘導單倍體的方法主要有化學藥劑誘導孤雌生殖獲得單倍體、種間遠緣授粉或輻射花粉授粉誘導孤雌生殖獲得單倍體、延遲授粉、未授粉子房和胚珠培養、花藥培養和游離小孢子培養等。其中前3種方法需要種植較大的植株群體進行人工誘導，工作量巨大，周期長，耗時耗力，成本較高且誘導率低，難以利用；而未授粉子房和胚珠培養、花藥培養胚狀體誘導率和植株再生率較低，并存在體細胞干擾的問題，對再生植株鑒定的工作量增大。而游離小孢子培養與其他幾個方法相比具有明顯的優勢：直接從花藥或者花蕾中游離出來的小孢子是天然分散的單倍體細胞，數量巨大，基因型豐富，便于進行多種遺傳操作和研究小孢子離體發育機制，能夠在較寬的基因范圍內以較高的誘導率得到小孢子胚和再生植株，可以排除體細胞影響，更易獲得純合體植株，小孢子培養獲得的植株后代一般表現整齊，生活力穩定。因此該技術越來越受到關注，應用最為廣泛，是人工獲得單倍體的重要途徑。同時，在游離小孢子培養過程中也有可能發生染色體加倍，直接獲得雙單倍體材料。

發明內容

技術問題??本發明的目的是提供一種黃瓜游離小孢子培養方法，有效地游離純化黃瓜小孢子，制備小孢子懸浮液，并進行小孢子離體培養獲得再生植株。該方法可用于黃瓜游離小孢子培養獲得單倍體、雙單倍體等黃瓜材料，也為其他作物的小孢子游離、純化、小孢子懸浮液制備及游離小孢子培養提供借鑒。

技術方案本發明提供了一種黃瓜游離小孢子的培養方法。其過程是將單核靠邊期小孢子從花藥中游離出來，之后純化小孢子、制備小孢子懸浮液進行游離小孢子培養，獲得再生植株。具體步驟如下：

1)取樣與預處理在盛花期于晴天上午9:00～10:00從健壯植株上取花蕾。采用顯微鏡鏡檢的方法鑒定小孢子發育時期。選取小孢子發育處于單核靠邊期的花蕾進行低溫預處理。

2)花蕾消毒將花蕾先在75％酒精溶液里浸30s，然后用0.1％升汞消毒8min，最后用無菌水沖洗3次，每次30～60s；

3)游離、純化小孢子及懸浮液制備采用擠壓法游離小孢子，使用過濾和離心的方法純化小孢子，之后用用液體培養基懸浮小孢子，并用血球計數板計數調整小孢子密度。

4)胚狀體誘導用直徑60mm的培養皿分裝小孢子懸浮液，用Parafilm封口膜封口后，在25℃下靜止暗培養至產生肉眼可見的胚狀體，之后進行60r·min^-1振蕩暗培養至形成子葉形胚。

5)胚狀體萌發將子葉形胚轉移至胚狀體萌發培養基上，在25℃、4000LX、16h·d^-1下光照培養，至形成無根苗或根較弱的再生植株。

6)誘導生根與植株再生將無根苗以及根較弱的再生植株轉接至生根培養基上，在25℃、4000LX、16h·d^-1下進行光照培養至形成健壯的根。

7)馴化與移栽將生長健壯的再生植株從培養瓶中取出并用無菌水洗凈培養基，然后轉移到裝有滅菌土的育苗穴盤。將穴盤苗置于小拱棚中馴化，2周后將其移栽定植于大棚溫室。

8)染色體鑒定參照陳勁楓和錢春桃(陳勁楓，錢春桃.利用幾種園藝作物卷須制片鑒定染色體數目的研究.園藝學報，2002，29(4)：378～380)的方法對再生植株進行體細胞染色體計數，確定其倍性。