[發明專利]黃瓜游離小孢子的培養方法

無效

• 申請號: 200810022098.5
• 申請日: 2008-07-18
• 公開（公告）號: CN101317548A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 陳勁楓;詹艷;錢春桃;婁群峰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01H1/08;A01H1/04;C12N3/00;C12N5/04
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 張素卿

1.黃瓜游離小孢子的培養方法，包含下列步驟：

1)取樣以‘Poinsett97’作為材料，在盛花期于晴天上午9:00～10:00從健壯植株上取花蕾，將花藥從花蕾中剝出，置于載玻片上，滴幾滴去離子水浸沒花藥，用鑷子輕軋花藥使小孢子游離出來，去除殘留的花藥組織，蓋上蓋玻片，在OLYMPUS顯微鏡下觀察，選取小孢子發育處于單核靠邊期的花蕾用于游離小孢子培養，將花蕾置于4℃下預處理2d；

2)花蕾消毒將花蕾先在75％酒精溶液里浸30s，然后用0.1％升汞消毒8min，最后用無菌水沖洗3次，每次30～60s；

3)游離、純化小孢子將消毒后的花蕾置于10mL離心管中，加入4～5mL配方為B₅+質量比13％蔗糖，pH為5.8，用0.22μm微孔濾膜過濾滅菌的B₅-13提取液，用玻璃棒擠壓花蕾使小孢子釋放出來；使用孔徑為76μm的細胞篩過濾；濾液在600r·min^-1的轉速下離心5min，重復離心3次，至上清無色透明；棄上清，用配方為NLN+0.5mg·L^-12，4-D+0.2mg·L^-16-BA+質量比13％蔗糖，pH為5.8，用0.22μm微孔濾膜過濾滅菌的液體培養基懸浮小孢子；最后使用血球計數板計數，調整小孢子密度約為1.0×10⁵個·mL^-1；

4)胚狀體誘導用直徑60mm的培養皿分裝小孢子懸浮液，每皿2mL，用Parafilm封口膜封口后，在25℃下進行靜止暗培養至產生肉眼可見的胚狀體，之后進行60r·min^-1振蕩暗培養至形成子葉形胚；

5)胚狀體萌發將子葉形胚轉移至配方為MS+0.2mg·L^-16-BA+質量比3％蔗糖+質量比0.8％瓊脂，pH為5.8，在121℃下高壓滅菌20分鐘的MS-BA胚狀體萌發培養基上，在25℃、4000LX、16h·d^-1下光照培養，20～25d后形成無根苗或根較弱的再生植株；

6)誘導生根與植株再生將無根苗以及根較弱的再生植株轉接至配方為MS+0.2mg·L^-1IBA+質量比3％蔗糖+質量比0.8％瓊脂，pH為5.8，在121℃下高壓滅菌20分鐘的生根培養基上，在25℃、4000LX、16h·d^-1下進行光照培養，10d后即獲得完整的再生植株。