[發(fā)明專利]一種提高2－酮基－L－古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810021590.0
• 申請(qǐng)日: 2008-08-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101338335A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-01-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉立明;張靜;陳堅(jiān);劉杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P39/00
• 分類號(hào): C12P39/00;C12P17/04;C12R1/11;C12R1/01
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種提高2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic?acid，KGA)又稱維生素C，簡(jiǎn)寫(xiě)為KGA，本發(fā)明涉及一種維生素C發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素。通過(guò)研究微量元素液(金屬離子、維生素、氨基酸)對(duì)維生素C發(fā)酵的影響，得到維生素C發(fā)酵最顯著的影響因素。

背景技術(shù)

維生素C，又稱抗壞血酸，作為人體必需的一種維生素和抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于制藥、食品、飲料、化妝品和飼料等工業(yè)中。

隨著維生素C應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，維生素C的市場(chǎng)需求量也在不斷的增長(zhǎng)。最早實(shí)現(xiàn)維生素C工業(yè)化生產(chǎn)的工藝是德國(guó)Reichstein于1934年發(fā)明的五步化學(xué)反應(yīng)和一步生物轉(zhuǎn)化，先將葡萄糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸(2-Keto-L-Gulonic?acid，2-KGA)，再經(jīng)酯化生成維生素C。但該法存在能耗高、消耗大量有機(jī)溶劑、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)。因此需要開(kāi)發(fā)更經(jīng)濟(jì)、更具有競(jìng)爭(zhēng)力的生物轉(zhuǎn)化法或完全生物轉(zhuǎn)化法。與“萊氏法”生產(chǎn)維生素C的六步化學(xué)反應(yīng)相比，用微生物從D-山梨醇或D-葡萄糖經(jīng)兩步發(fā)酵生成2-KGA，再經(jīng)甲醇酯化生產(chǎn)維生素C的生物技術(shù)法具有工藝流程簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低廉，環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。

玉米漿是玉米淀粉等產(chǎn)品加工過(guò)程中的浸泡水經(jīng)濃縮至含固形物70％左右后得到的副產(chǎn)品，其構(gòu)成成分較復(fù)雜，其中蛋白質(zhì)含量高達(dá)40％以上(按干基計(jì))，氨基酸、生物素和維生素(如煙酸等)含量較豐富。玉米漿作為一種較好的微生物生長(zhǎng)或代謝產(chǎn)物合成的促進(jìn)劑已廣泛應(yīng)用于酶制劑、抗生素、生化藥物等眾多發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程。在維生素C發(fā)酵過(guò)程中，玉米漿批次之間的差異會(huì)造成2-KGA的產(chǎn)量和發(fā)酵周期不穩(wěn)定。確定菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸需要的特殊生長(zhǎng)因子是控制2-KGA生產(chǎn)穩(wěn)定性的先決條件。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是得到一種維生素C發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素。檢測(cè)玉米漿中的主要微量元素(金屬離子、維生素、氨基酸)，并利用微量元素混合液代替玉米漿進(jìn)行維生素C發(fā)酵，研究維生素C發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種提高2-酮基-L-古龍酸KGA發(fā)酵生產(chǎn)穩(wěn)定性的方法，2-酮基-L-古龍酸又稱維生素C，確定維生素C發(fā)酵的關(guān)鍵影響因素，采用正交試驗(yàn)來(lái)考察金屬離子混合液、氨基酸混合液及維生素混合液在維生素C發(fā)酵中的作用；在得出金屬離子混合液是細(xì)胞生長(zhǎng)、KGA合成和L-山梨糖消耗的顯著影響因素的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)考察各種金屬離子對(duì)維生素C發(fā)酵的影響；發(fā)現(xiàn)，增加Mg²⁺濃度能促進(jìn)KGA合成，是維生素C發(fā)酵的顯著影響因素；

利用氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter?oxydans)IFO?3293和巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)ATCC?21916為生產(chǎn)菌株；

優(yōu)選后確定的發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)：山梨糖80，尿素12，碳酸鈣5，玉米漿粉5，用硫酸鎂或氯化鎂調(diào)節(jié)Mg²⁺濃度達(dá)到0.17g，磷酸二氫鉀1；pH?6.7-7.0；

搖瓶培養(yǎng)條件：將30℃、200rpm下培養(yǎng)18h的混菌種子以10％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基于30℃、200rpm條件下培養(yǎng)72h。

采用優(yōu)化組合進(jìn)行維生素C發(fā)酵的KGA產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為75.2g/L和0.94g/g，與普通培養(yǎng)基相比，KGA產(chǎn)量(67g/L)和產(chǎn)率(0.84g/g)分別提高了12.24％和11.9％。

1、菌株：巨大芽孢桿菌ATCC?21916(Bacillus?megaterium，俗稱大菌)、氧化葡萄糖酸桿菌IFO?3293(Gluconobacter?oxydans，俗稱小菌)，購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保藏中心。兩種菌株進(jìn)行混合種子培養(yǎng)，即為混菌種子。

2、培養(yǎng)基

種子和斜面培養(yǎng)基(g/L)：山梨糖20，酵母膏3，蛋白胨10，牛肉膏3，玉米漿粉0.15，尿素1，碳酸鈣1，硫酸鎂0.2，磷酸二氫鉀1；瓊脂20(斜面培養(yǎng)基)，pH?6.7-7.0。

優(yōu)選試驗(yàn)所用發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：山梨糖80，尿素12，碳酸鈣5，硫酸鎂0.1，磷酸二氫鉀1，微量液根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求添加；pH?6.7-7.0。

所述微量液：由金屬離子混合液，維生素混合液及氨基酸混合液根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求組成。