[發明專利]一種鄰苯二甲酸二異辛酯人工抗原的制備方法

無效

• 申請號: 200810021412.8
• 申請日: 2008-07-29
• 公開（公告）號: CN101328218A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發明（設計）人: 胥傳來;徐麗廣;彭池方;陳偉;馬偉;李灼坤
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07C205/57
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種鄰苯二甲酸二異辛酯人工抗原的制備方法，屬于生物化工技術領域。

背景技術

鄰苯二甲酸二異辛酯(Diethylhexyl?phthalate，DEHP)是酞酸酯的一種。酞酸酯作為增塑劑在塑料的加工生產中尤其是聚氯乙烯(PVC)的加工生產中被廣泛的使用。由于酞酸酯增塑劑與塑料基質之間沒有形成共價鍵，而是以氫鍵和范德華力連接，彼此保持各自獨立的化學性質，因而在接觸到包裝食品中所含的水、油脂時，便會溶出。經過研究發現酞酸酯是一種環境激素物質，它干擾生物為保持體內平衡并調節生長過程的正常激素的產生、釋放、轉移、代謝、反應和消除，或在未受損的生物后代中引起不良的健康影響和內分泌功能的改變。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(又稱鄰苯二甲酸二異辛酯，di-2-ethylhexylphthalate，DEHP)是鄰苯二甲酸酯類增塑劑中用量最大的一種，應用廣泛，在塑料中的含量可達60％。目前，國內外有關鄰苯二甲酸二異辛酯的檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、氣-質聯用法(GC-MS)、液-質聯用法(LC-MS)等，但這些方法不僅需要昂貴的儀器設備，專業的操作人員，對檢材的要求也比較高，并且需要進一步的樣本前處理才能進行，這已經不能達到現代檢測對快速、方便、準確的要求。近年來，國內外已經開展了對酞酸酯類免疫分析方法的研究，但國內外尚沒有針對鄰苯二甲酸二異辛酯的酶聯免疫檢測的報道，為了彌補這一空白，有必要制備鄰苯二甲酸二異辛酯人工抗原。

發明內容

本發明的目的是提供一種鄰苯二甲酸二異辛酯人工抗原的制備方法，所制備的產品可用于鄰苯二甲酸二異辛酯免疫分析方法的研究，為今后人們的研究提供了方便的途徑。

本發明的技術方案：一種鄰苯二甲酸二異辛酯人工抗原的制備方法，第一步為半抗原的制備及檢測，以4-硝基鄰苯二甲酸為原料，在濃硫酸的催化下與異辛醇發生酯化反應，然后利用鐵粉還原法使4-硝基鄰苯二甲酸二異辛酯苯環上的硝基還原為胺基，制備人工半抗原；第二步為人工抗原的制備及檢測，利用重氮化法對半抗原上的胺基進行重氮化并使之與牛血清蛋白結合，制備鄰苯二甲酸二異辛酯的人工抗原，即鄰苯二甲酸二異辛酯-牛血清蛋白。

其反應方程式為：

工藝步驟為：

(1)人工半抗原的制備：

①4-硝基鄰苯二甲酸二異辛酯的合成

稱取0.12mol的4-硝基鄰苯二甲酸于100mL的三頸燒瓶中，加入0.1mol即15.74mL的異辛醇，加入一定量的苯助溶，在攪拌的條件下，緩慢加入1.6mL的濃硫酸，加熱升溫至110-130℃，反應7-24h，減壓蒸去有機溶劑，油狀殘留加入到冷水中用質量濃度10％的Na₂CO₃溶液洗至下層水層無色，取上層得到暗紅色的油狀粗品，用無水乙醇進行重結晶，得到43mmol的4-硝基鄰苯二甲酸二異辛酯。

硅膠薄層板的制作：稱取硅膠12g，溶解在40mL?0.5％質量濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分攪拌成糊狀，超聲波振蕩1分鐘，均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中備用。

薄層層析法檢測：硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應液1μL點于線上，點樣結束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為乙酸∶正己烷體積比為1∶15，展開至薄板3/4處，取板，吹干溶劑。將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.76處觀察到顯色點作為反應終點。

②4-氨基鄰苯二甲酸二異辛酯的合成

稱取9mmol還原鐵粉于50mL圓底燒瓶中，加入10mL水、3mmol氯化銨，水浴中加熱15min。另稱取4-硝基鄰苯二甲酸二異辛酯3mmol，用一定量的甲醇溶解后，分3次加入上述的反應液當中，回流反應4-6h。趁熱過濾鐵粉，將濾液進行減壓蒸餾，得到的橙紅色殘留用少量熱甲醇溶液溶解，4℃析出1.06g橘紅色油狀液體的4-氨基鄰苯二甲酸二異辛酯作為半抗原備用。

薄層層析法檢測：硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應液1μL點于線上，點樣結束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為乙酸∶正己烷體積比為1∶15，展開至薄板3/4處，取板，吹干溶劑。將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.52處觀察到顯色點作為反應終點。

(2)人工抗原的制備：