[發明專利]一種鄰苯二甲酸二異辛酯人工抗原的制備方法

無效

• 申請號: 200810021412.8
• 申請日: 2008-07-29
• 公開（公告）號: CN101328218A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發明（設計）人: 胥傳來;徐麗廣;彭池方;陳偉;馬偉;李灼坤
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07C205/57
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種鄰苯二甲酸二異辛酯人工抗原的制備方法，其特征是以4-硝基鄰苯二甲酸為原料，在濃硫酸的催化下與異辛醇發生酯化反應，然后利用鐵粉還原法使4-硝基鄰苯二甲酸二異辛酯苯環上的硝基還原為胺基，制備人工半抗原；利用重氮化法對半抗原上的胺基進行重氮化并使之與牛血清蛋白結合，制備鄰苯二甲酸二異辛酯的人工抗原，即鄰苯二甲酸二異辛酯-牛血清蛋白；步驟為：

(1)人工半抗原的制備：

①4-硝基鄰苯二甲酸二異辛酯的合成

稱取0.12mol的4-硝基鄰苯二甲酸于100mL的三頸燒瓶中，加入0.1mol即15.74mL的異辛醇，加入一定量的苯助溶，在攪拌的條件下，緩慢加入1.6mL的濃硫酸，加熱升溫至110-130℃，反應7-24h，減壓蒸去有機溶劑，油狀殘留加入到冷水中用質量濃度10％的Na₂CO₃溶液洗至下層水層無色，取上層得到暗紅色的油狀粗品，用無水乙醇進行重結晶，得到43mmol的4-硝基鄰苯二甲酸二異辛酯；

薄層層析法檢測：硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應液1μL點于線上，點樣結束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為乙酸∶正己烷體積比為1∶15，展開至薄板3/4處，取板，吹干溶劑；將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.76處觀察到顯色點作為反應終點；

②4-氨基鄰苯二甲酸二異辛酯的合成

稱取9mmol還原鐵粉于50mL圓底燒瓶中，加入10mL水、3mmol氯化銨，水浴中加熱15min；另稱取4-硝基鄰苯二甲酸二異辛酯3mmol，用一定量的甲醇溶解后，分3次加入上述的反應液當中，回流反應4-6h；趁熱過濾鐵粉，將濾液進行減壓蒸餾，得到的橙紅色殘留用少量熱甲醇溶液溶解，4℃析出1.06g橘紅色油狀液體的4-氨基鄰苯二甲酸二異辛酯作為半抗原備用；

薄層層析法檢測：硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應液1μL點于線上，點樣結束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為乙酸∶正己烷體積比為1∶15，展開至薄板3/4處，取板，吹干溶劑；將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.52處觀察到顯色點作為反應終點；

(2)人工抗原的制備：

制備A液：稱取5mg半抗原于25mL燒杯中，加入1mL二甲基甲酰胺、0.1mL水和0.1mL的1M鹽酸，形成黃色溶液，冷卻至4℃，然后逐滴滴加1M亞硝酸鈉溶液，用淀粉碘化鉀試紙監測，直到試紙變藍灰色停止滴加，4℃下攪拌1h，此液為A液；

制備B液：稱取10mg牛血清蛋白溶于1.5mL的pH9.0硼酸鹽緩沖液，4℃保存，此液為B液；

在4℃攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液中，并用1N的氫氧化鈉溶液調節pH，使pH保持在9；在4℃條件下攪拌保存過夜，得人工抗原混合液；

透析袋前處理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；

將人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氫鈉溶液和2×2L的去離子水透析4-6天，使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原：鄰苯二甲酸二異辛酯-牛血清蛋白。

(3)人工抗原的鑒定：鄰苯二甲酸二異辛酯-牛血清蛋白采用紫外掃描測定其偶聯比，在吸收波長310nm處測吸光值，并計算其偶聯比。