[發明專利]一種含氰基擬除蟲菊酯農藥多殘留分析的酶聯免疫吸附檢測方法

無效

• 申請號: 200810021222.6
• 申請日: 2008-07-22
• 公開（公告）號: CN101334408A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 胥傳來;殷祥剛;郝曉蕾;李雅麗;袁媛
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N21/78
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種含氰基擬除蟲菊酯農藥多殘留分析的酶聯免疫吸附檢測方法，具體地說，涉及一種適用于含氰基擬除蟲菊酯(a-Cyano-Pyrethroid)農藥多殘留分析的酶聯免疫吸附檢測方法，屬于免疫分析技術領域。

背景技術

擬除蟲菊酯(Pyrethroid)是一類在天然除蟲菊酯化學結構研究基礎上發展而來的仿生藥物。天然除蟲菊的應用已有悠久的歷史，由于其具有擊倒力強，殺蟲作用快，廣譜性，易降解，對高等動物及鳥類低毒性，使用安全，對環境污染小等特點，被廣泛用于茶園、果園、農田等害蟲的防治，尤其含氰基擬除蟲菊酯(a-Cyano-Pyrethroid)應用更為廣泛。隨著國際標準的提高，我國貿易的國際化，綠色壁壘森嚴，我國農副產品特別是紡織品、茶葉、水果中的農藥殘留問題成為出口貿易的主要障礙，要求開發應用快速殘留檢測技術來加強產地農副產品中多種農藥殘留的監控。而傳統的農藥殘留分析主要依靠氣相色譜、液相色譜、氣質聯用、液質聯用等，這些方法需要有昂貴的儀器，而且需要經過繁瑣的前處理，很難達到快速簡便的現場檢測要求。因此，有必要研究更有效快捷的檢測方法，即適用于含氰基擬除蟲菊酯農藥多殘留分析的酶聯免疫吸附檢測方法。

發明內容

(一)要解決的技術問題

本發明的目的在于建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的酶聯免疫吸附檢測方法，用于含氰基擬除蟲菊酯農藥多殘留的批量、快速檢測。

(二)技術方案

為實現上述目的，本發明建立了一種含氰基擬除蟲菊酯農藥多殘留分析的酶聯免疫吸附檢測方法，該方法包括對檢測方法的優化。

(1)抗原的包被

用半抗原間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯與卵清蛋白OVA的偶聯復合物作為包被抗原，以0.05M、pH?9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋包被抗原1∶100～1∶200，濃度為4～8μg/mL作為包被液，在酶標板的每孔中加入100μL包被液，4℃孵育過夜，用含2％OVA的上述碳酸鈉緩沖液作為封閉液封閉；

(2)競爭反應

將免疫制備的間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗體用抗體稀釋液：含1％明膠、含0.5％吐溫-20、pH＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液PBST，按1∶100～1∶200比例稀釋后，加入酶標板中，每孔加50μL；同時每孔分別加入用標準品稀釋液稀釋的0ng/mL，0.1ng/mL，1.0ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL，10000ng/mL，100000ng/mL一系列濃度之一的含氰基擬除蟲菊酯農藥標準品，每孔加50μL，37℃孵育1h后以PBST洗滌液洗滌3～5次；

(3)加酶標二抗

加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP，以抗體稀釋液稀釋為1∶5000，每孔加100μL，37℃溫育1h后以PBST洗滌液洗滌3～5次；

(4)顯色

每孔加入100μL顯色液，暗處37℃反應15min，取出后每孔加入100μL、2mol/L的硫酸終止液，用酶標儀測定吸光值A₄₅₀，與所作的標準曲線對比算出待測含氰基擬除蟲菊酯的濃度。

標準品稀釋液的配方為在體積含量30％甲醇的pH＝6.5的PBS中加入質量比為5％的氯化鈉。

PBST洗滌液的配方為1000mL蒸餾水中加入氯化鈉4～6g、磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉2～4g、氯化鉀3～6g、吐溫-200.5～3mL。

顯色液包括A液和B液，A液配方為每100mL水中加入0.933g檸檬酸，3.68g?Na₂HPO₄·12H₂O，18μL30％H₂O₂；B液配方為60mg四甲基聯苯胺溶于100mL乙二醇；使用時按A∶B＝1∶1的比例使用。

含氰基擬除蟲菊酯多克隆抗體是用間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯復合物免疫新西蘭大白兔制備。

本發明方法的檢測分析原理是：