[發明專利]一種添加脯氨酸促進丙酮酸過量積累的方法

有效

• 申請號: 200810020576.9
• 申請日: 2008-01-29
• 公開（公告）號: CN101225410A
• 公開（公告）日: 2008-07-23
• 發明（設計）人: 堵國成;徐沙;劉立明;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P7/40
• 分類號: C12P7/40;C12R1/645
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種添加脯氨酸促進丙酮酸過量積累的方法，屬于定向改變和優化微生物代謝功能、優化發酵過程技術領域。

技術背景

丙酮酸是多種氨基酸、維生素及其它有用物質的重要前體，在化工、制藥及農用化學品工業中有著廣泛的用途，因價格昂貴，故推廣應用受到限制。

丙酮酸是一種十分重要的有機化工中間體，主要應用于醫藥、農藥和日化工業，近年來丙酮酸的開發應用己成為國內外研究的熱點。丙酮酸在醫藥工業中被用于合成治療高血壓新藥血管緊張肽II抗藥、系列蛋白酶抑制劑、鎮靜劑、消炎陣痛藥辛可芬、抗結核藥異煙肼丙酮酸鈣、解熱藥2-苯基喹啉-4-羧酸、驅蟲藥恩波吡維胺、藥物磷酸烯醇丙酮酸、4-甲唑甲酸、抗病毒劑氮雜喹喔啉以及噻咪唑藥物等。值得一提的是，丙酮酸在人體檸檬酸循環和合成氨基酸及其糖類中是重要的中間體，可以使脂肪代謝率達到48％，對人體安全性高，因此近年來國外發達國家利用丙酮酸這一特性，以其鈣鹽作為減肥保健藥品。國外有關媒體已經報道，含有丙酮酸鈣的減肥藥已經風靡全球，成為減肥藥市場上的新寵。

在丙酮酸的發酵過程中，為了維持發酵體系pH處于最適范圍而流加一定量的NaOH等堿性物質，且隨著NaOH等的添加，發酵液的滲透壓不斷升高，導致細胞凋亡和積累丙酮酸能力的下降，最終影響有機酸生產效率。

本發明通過研究脯氨酸對高滲條件下酵母細胞的保護作用，提出針對性更強的發酵過程優化策略。

發明內容

本發明的目的是提供一種添加脯氨酸促進丙酮酸過量積累的方法，添加脯氨酸作為滲透相容性物質實現丙酮酸過量積累，利用本發明能提高丙酮酸發酵的產量、生產強度和得率。

本發明的技術方案：一種添加脯氨酸促進丙酮酸過量積累的方法，其特征是利用多重維生素營養缺陷型的光滑球擬酵母(T.glabrata)CCTCC?M202019為生產菌株，當發酵過程中丙酮酸鈉濃度達到0.4mol/L時，向培養基中添加脯氨酸，使培養基中脯氨酸濃度達到1g/L，脯氨酸作為滲透相容性物質保護光滑球擬酵母細胞，促進CCTCC?M202019合成丙酮酸。

1、菌株

光滑球擬酵母(T.glabrata)CCTCC?M202019為煙酸(NA)、生物素(Bio)、硫胺素(B1)和吡哆醇(Pdx)四種維生素營養缺陷型，且丙酮酸脫羧酶活性組成型降低，為本研究室選育的菌株，該菌種已申請中國專利，專利號為02113142.2。

2、培養基

種子和斜面培養基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨10，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂0.5；瓊脂20(斜面培養基)，pH?5.5。

基本發酵培養基(L)：葡萄糖100g，NH₄SO₄?7g，乙酸鈉6g，KCl?5g，KH₂PO₄?5g，Mg₂SO₄·7H₂O?0.8g，pH?5.5。

3、培養：

斜面培養：30℃、200rpm下培養24h；

搖瓶培養：將種子以10％的接種量轉入基本發酵培養基于30℃、200rpm條件下培養24h，按實驗要求添加不同濃度的煙酸、生物素、硫胺素和吡哆醇。

發酵培養：最后在7L發酵罐中進行發酵，發酵條件為：pH?5.5，攪拌轉速400rpm，通氣速率1.0vvm。

細胞干重的測定：取一定量的菌懸液置于10mL容量瓶中，加2mL鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，加入去離子水定容至10mL，搖勻，用UV?7500型可見分光光度計，于660nm處比色測OD值，用細胞干重標準曲線算得細胞干重。

丙酮酸濃度的測定：高效液相色譜(HPLC)

儀器：Agilent1100高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、視差折光檢測器和工作站)，

色譜條件：

色譜柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm

流動相：0.1％H₃PO₄

流速：1mL/min

柱溫：28℃

進樣量：10μL

紫外檢測器波長：210nm

樣品制備：5mL發酵液在10000rpm下離心10min，取上清液移入試管中以備測丙酮酸時用。測丙酮酸時，取1mL上清液移入50mL容量瓶中，去離子水定容至刻線，經0.45μm濾膜過濾后，濾液供液相色譜分析用。