[發明專利]一種構建和生產限制性內切酶Ecop15I的方法

有效

• 申請號: 200810019839.4
• 申請日: 2008-03-19
• 公開（公告）號: CN101538579A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 陸毅祥;陳莉;黃兵;孫云成;戴雪;朱遠源
• 申請（專利權）人: 百奧生物技術（南通）有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/55;C12N9/16;C12N1/21;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及重組III型限制性Ecop15I內切酶共表達質粒的構建、表達與純 化，屬于生物工程領域。通過本發明所提供的方法，獲得了純度較高、活力較 好的重組型Ecop15I限制性內切酶，為大規模生產提供了有效的途徑。同時，所 述的Ecop15I內切酶可以作為基因表達序列分析和相關基因識別的工具，具有很 好的應用價值。

背景技術

“限制性內切酶”一般認為是能識別雙鏈DNA上4到8個核苷酸的特異性 序列，且能切割該序列的內切酶的總稱。目前，已報道有2900余種限制一修飾 (R/M)系統被鑒別，根據其亞基組成、催化機制、酶切位置、識別序列、輔助 因子等因素，限制性內切酶可分為三大類。I型限制性內切酶是一類兼有限制性 和甲基化活性的多亞基蛋白復合體，可以在遠離其識別位點處任意切割DNA鏈。 II型限制性內切酶是獨立于對應甲基化酶的一種限制酶，其在識別位點之中或臨 近的確定位點特異性地切開DNA鏈，產生確定的序列末端、限制片段，II型限 制性內切酶大部分都具有嚴格的底物特異性，識別4～6bp的回文序列。III型限 制性內切酶是兼有限制、修飾兩種功能的酶，主要識別反向重復序列，在識別 位點之外不完全地切開DNA鏈。

限制性內切酶Ecop15I是大腸桿菌P15質粒編碼的III型限制性內切酶，是 由2個Mod亞基和2個Res亞基折疊形成407KDa大小的低聚復合酶。Mod亞 基通過限制與修飾的競爭作用來實現識別和修飾雙重功能，其識別未甲基化的、 反向的、非回文結構的序列(5’-CAGCAG-3’)。Ecop15I在識別位點下游上鏈(Top strand)25～26nt位置和下鏈(Bottom?strand)27或28位置，在輔助因子Mg2+ 和ATP的作用下，酶切DNA序列。特別對DNA具有一對未甲基化的、反向的、 且具有一定空間距離的、對立位置的識別位點，酶切最為有效。其主要用途是 在基因表達分析(Serial?Analysis?of?Gene?Expression，SAGE^TM)中具有重要作用， 傳統的SAGE僅能標簽14個堿基序列，而在改進的“longSAGE^TM”方案中也

只有21個堿基序列的標簽，而Ecop15I可以標簽超過25個堿基序列，提高 了鑒定基因的效率和正確率。Ecop15I對基因的結構和表達的修飾發揮了很大的 作用，從而為各種醫學、藥物和農業應用提供了巨大的潛力。

III型限制性內切酶Ecop15I在基因表達系列分析具有重要作用，但是目前 缺少實現大規模的表達和純化的方法。目前生產這種酶的方式和一般限制性內 切酶并無不同，其步驟一般是：

1、通過重組DNA技術，從微生物中獲得目的基因并加以克隆。

常使用噬菌體感染用于識別和選擇限制性酶的克隆，但此法成功率較低。 這種方法是以包含轉移限制-修飾系統為最初特征，由質粒裝載到大腸桿菌克 隆載體上。此法通過克隆不斷增加的限制-修飾系統，包含通過選擇有甲基酶 基因活性地克隆，但這一選擇系統并不總是得到完全的限制系統，而是只產生 出甲基化酶基因。在構建質粒庫后，然后將其在適用宿主上轉化，制備含內切 酶的粗提物，通過活性分析篩選出所需的克隆。

2、采用一些工藝技術對含有限制性內切酶基因的克隆進行過表達。

這些技術能夠被單獨或結合使用以獲得限制性酶最大量的表達，主要有： (1)、啟動子通過大腸桿菌能夠被很好的識別，直接插入到上游起始部分；(2)、 插入一個位于基因上游的核糖體結合位點；(3)、通過定向誘變或使用密碼子自 身合成基因從而改變基因的DNA序列；(4)、使用多聚酶鏈式反應(PCR)和 合成基因5′端和3′端的雜交引物而放大表達。

3、在合適的培養基中，用發酵器增值攜帶該內切酶修飾性和限制性的克隆， 以生產該限制性核酸內切酶，然后經離心收獲細胞并經超聲振蕩破壞之，制得 含限制性內切酶活性的細胞粗提物；

4、用標準的蛋白質純化技術如親和層析或離子交換層析法純化含限制性內 切酶活性的細胞粗提物。

采用上述傳統方法，對于大規模生產III型限制性內切酶EcoP15I存在以下問 題：