[發明專利]一種構建和生產限制性內切酶Ecop15I的方法

有效

• 申請號: 200810019839.4
• 申請日: 2008-03-19
• 公開（公告）號: CN101538579A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 陸毅祥;陳莉;黃兵;孫云成;戴雪;朱遠源
• 申請（專利權）人: 百奧生物技術（南通）有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/55;C12N9/16;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種構建III型限制性內切酶EcoP15I共表達質粒的方法，所述Ecop15I 的Res亞基C端和Mod亞基Ｎ端各自分別融合帶有6×His?Tag層析標簽，其構 建步驟包括：

（1）合成引物，通過兩端引物在Mod片段頭尾分別添加BamHI、SaII酶 切位點，并在BamHI酶切位點后添加G堿基，獲得Eco_Mod基因；在Res片 段頭尾分別添加KpnI、XhoI酶切位點，通過Res基因片段中間的Bg1II酶切位 點將Res片段分為兩段，為Eco_ResI和Eco_ResII基因；得到包括Res亞基和 Mod亞基的3段基因Eco_Mod、Eco_ResI和Eco_ResII，3段基因分別通過平端 克隆，裝載到pUC57中，獲得pMod、pRes_I和pRes_II三個質粒；將pRes_I 和pRes_II用Bg1II和NotI雙酶切后，T4連接酶酶連，獲得完整的Res片段的 pRes_All質粒；

（2）將pMod質粒與pACYCDuet-1質粒BamHI和SalI雙酶切后酶連，獲 得包含Mod亞基的pACYC_Mod質粒，再與pRes_All質粒KpnI和XhoI雙酶切 后酶連，獲得包含完整的EcoP15I兩個亞基的Ecop15I共表達質粒。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述層析標簽6×His?Tag是組氨酸鎳 （Ni^2＋）親和層析標簽。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述Ecop15I共表達質粒為過表達質 粒。

4.一種生產III型限制性內切酶EcoP15I的方法，步驟包括：

（1）用重疊PCR方法合成EcoP15I基因，其中Res亞基C端和Mod亞基 Ｎ端各自分別融合帶有6×His?Tag層析標簽；

（2）構建EcoP15I共表達質粒，包括：

a.合成引物，在兩端引物的Mod片段頭尾分別添加BamHI、SaII酶切位點， 并在BamHI酶切位點后添加G堿基，獲得Eco_Mod基因；在Res片段頭尾分 別添加KpnI、XhoI酶切位點，通過Res基因片段中間的Bg1II酶切位點將Res 片段分為兩段，為Eco_ResI和Eco_ResII基因；得到包括Res亞基和Mod亞基 的3段基因Eco_Mod、Eco_ResI和Eco_ResII，3段基因分別通過平端克隆，裝 載到pUC57中，獲得pMod、pRes_I和pRes_II三個質粒；將pRes_I和pRes_II 用Bg1II和NotI雙酶切后，T4連接酶酶連，獲得完整的Res片段的pRes_All質 粒；

b.將pMod質粒與pACYCDuet-1質粒BamHI和SalI雙酶切后酶連，獲得 包含Mod亞基的pACYC_Mod質粒，再與pRes_All質粒KpnI和XhoI雙酶切后 酶連，獲得包含完整的EcoP15I兩個亞基的Ecop15I共表達質粒；

（3）EcoP15I的轉化和表達；

（4）EcoP15I大規模培養和表達；

（5）EcoP15I純化。

5.根據權利要求4所述的方法，其中純化EcoP15I-的步驟包括：

（1）鎳柱結合緩沖液重懸離心后菌體，超聲波破碎菌體，離心取上清粗蛋 白；

（2）過鎳親和層析純化柱，分步收集；

（3）取純度和濃度較高的收集樣混合、透析；

（4）過陰離子DEAE離子交換層析柱，步進式洗脫，分步收集；

（5）取純度和濃度較高的收集樣混合，透析，測Ecop15I總濃度。