[發明專利]青島結縷草與溝葉結縷草雜交后代真實性的分子鑒定方法

無效

• 申請號: 200810019737.2
• 申請日: 2008-03-13
• 公開（公告）號: CN101240340A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 劉建秀;薛丹丹;郭海林;郭愛桂
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 張素卿

一、技術領域

本發明涉及結縷草屬植物雜交后代真實性的分子鑒定方法，屬于生物技術領域。專用于青島結縷草和溝葉結縷草雜交后代真實性鑒定的快速準確檢測。

二、背景技術

雜交育種作為一種傳統育種方法已相當成熟，是植物遺傳改良中常用的技術策略，利用草坪草性狀差異明顯的親本進行雜交育種是選育優質、優良新品系的重要途徑。結縷草的開花習性為雌蕊先熟，雄蕊后熟，郭海林等的研究表明結縷草的自交結實率0.0～54％，平均為16.15％，因此雜交后代有可能混雜有部分的自交種。據此，需要首先對結縷草的雜交后代進行真實性的鑒定，以篩選出真正的雜種為后面的優良雜交品種選育提供基礎。多年來，許多育種工作者通過田間植株形態來鑒定雜交后代，但形態特征容易受環境條件的影響，不能真實、準確地反應其后代的遺傳變異。也有用細胞學、同工酶電泳等方法進行鑒定的報道，但細胞學鑒定的方法只適用于親本材料具有不同倍性染色體的植物，且費時、費力，要求高、操作復雜等，結縷草屬植物染色體數目均為2n＝40，且染色體均為短棒狀，很難加以鑒定。而同工酶鑒定的重復性及可靠性不夠好，影響檢測的準確性，而使其廣泛應用受到了限制。因此，尋找一種穩定可靠又快速簡便的植物雜交后代的鑒定方法迫在眉睫。

DNA是生物的遺傳物質，DNA的多態性是生物多樣性的本質內容。目前，隨著分子標記技術的不斷發展和廣泛應用，國內外在植物雜交育種的后代鑒定中也越來越多地應用各種分子標記技術，如RAPD、SSR、ISSR、AFLP等分子標記。但RAPD標記受反應條件的影響較大，重復性差；SSR單個標記提供的信息量較少，引物具有物種特異性，開發難度也大，成本較高；ISSR標記的擴增條件需要較長時間的摸索，且多為共顯性標記；AFLP標記操作復雜，要求嚴格，成本高等不足之處。一種基于PCR的新型分子標記技術---SRAP(Sequence-related?Amplified?Polymorphism)標記的發明和應用彌補了以上分子標記的不足且具備了它們的優點。此技術是由美國加里弗尼亞大學，蔬菜系Li和Quiros于2001年在蕓薹屬植物中開發提出的。SRAP標記是根據基因外顯子中豐富的GC含量和內含子、啟動子中豐富的TA含量的特點，利用獨特的引物設計對ORFs(Open?reading?frames，開放閱讀框架)進行擴增，因不同個體間的外顯子、內含子和啟動子的不同而產生多態性。SRAP標記簡單、穩定可靠、重復性好、多態性高、在基因組中分布均勻、引物非特異性、少量引物可組配多種引物對等優點使其在多種植物中得到廣泛的應用。但目前SRAP標記在植物雜交后代鑒定中的應用甚少，更未見用于青島結縷草和溝葉結縷草雜交后代真實性鑒定。

結縷草(zoysia?Willd)是一種多年生暖季型草坪草，因其具有抗性強、耐踐踏、彈性好、養護要求低、適應性廣、壽命長等優良特征，被世界公認為是一種優良的草坪草。青島結縷草(Zoysia.japonica?Steud.cv.Qingdao)是我國草坪育種者通過系統選育的方法選育出的新品種，具有可通過種子種植，生長速度較快，抗寒性較好等優點，但葉色灰綠，密度較低，枯萎期較早，質地較粗糙；溝葉結縷草品種Diamond(Marcum?et?al，1998)特點是葉細草密，色澤宜人，枯萎期較晚，但其抗寒性較差，成坪速度慢。利用坪用性狀差異明顯的親本進行雜交育種是選育優質、優良新品系的重要途徑。因此通過二者雜交，以期獲得色澤較好、綠期長、質地較好、抗寒性較強的優良雜交后代新品系。如能在雜交后代新品系的綜合鑒定之前，采用快速、準確的雜種鑒定方法，對雜交后代的真實性進行鑒定，從而為育種工作的進一步開展奠定基礎。本發明采用非特異性分子標記-SRAP標記對青島結縷草和溝葉結縷草兩親本及其后代進行了分子水平的多態性分析，從本研究的SRAP分析結果中可以看出，SRAP標記鑒定的結果條帶清晰、穩定、可靠，因此該分子標記非常適合用于青島結縷草和溝葉結縷草植物雜交后代真實性的室內鑒定，也可用雜交結縷草品種鑒定和純度分析。

三、發明內容

技術問題??本發明的目的是解決現有技術中結縷草屬植物雜交后代真實性的田間鑒定檢測方法和其它分子鑒定所需時間長，消耗大、準確性差的問題，提供青島結縷草和溝葉結縷草雜交后代真實性的分子鑒定方法，對青島結縷草和溝葉結縷草雜交后代進行SRAP分子標記鑒定，快速、準確。

技術方案

檢測青島結縷草和溝葉結縷草雜交后代的SRAP引物，包括：

引物對Me1+Em1

正向引物5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’