[發(fā)明專利]青島結(jié)縷草與溝葉結(jié)縷草雜交后代真實性的分子鑒定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810019737.2
• 申請日: 2008-03-13
• 公開（公告）號: CN101240340A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發(fā)明（設計）人: 劉建秀;薛丹丹;郭海林;郭愛桂
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 張素卿

1、檢測青島結(jié)縷草和溝葉結(jié)縷草雜交后代的SRAP鑒定引物，包括：

引物對Me1+Em1

正向引物5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’

反向引物5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’；和

引物對Me4+Em8

正向引物5’-TGAGTCCAAACCGGACA-3’

反向引物5’-GACTGCGTACGAATTGCC-3’；和

引物對Me5+Em5

正向引物5’-TGAGTCCAAACCGGTGC-3’

反向引物5’-GACTGCGTACGAATTAAC-3’。

2、權(quán)利要求1所述引物用于青島結(jié)縷草和溝葉結(jié)縷草雜交后代真實性的鑒定方法，其特征在于，用權(quán)利要求1所述的三對引物對青島結(jié)縷草和溝葉結(jié)縷草雜交組合的后代進行鑒定：

首先用Me1+Em1引物對對雜交后代進行鑒定，擴增結(jié)果有父本Z123的特異性條帶280bp的被確定為真雜種，其余沒有特異性條帶280bp的后代用于下一步鑒定；

接著用Em4+Em8引物對對上述沒有特異性條帶280bp的后代進行第二次鑒定，結(jié)果有父本特異帶155bp和135bp的被確定為真雜種，其余沒有父本特異帶155bp和135bp的后代用于下一步鑒定；

再用Me5+Em5引物對對上述沒有父本特異帶155bp和135bp的后代進行第三次鑒定，結(jié)果有父本的特異條帶270bp的被確定為真雜種；其余則為假雜種。

3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，

材料基因組DNA的提取方法為：將葉片在液氮中研磨后，加入DNA提取液攪勻，65℃水浴1hr；冷卻至室溫后加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻后在搖床上搖動1hr；3000rpm離心30min；取上清液加入2倍體積預冷的無水乙醇使DNA沉淀，-20℃放置1小時；挑出DNA，加入70％乙醇洗滌1-2次；吹干DNA，加入TE在室溫下溶解；加入3mlTE溶解DNA后，再次加入氯仿/異戊醇混勻，6000rpm離心；取上清液加入2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，-20℃放置1hr；離心后倒掉上清液，鉤出沉淀，用70％的乙醇洗滌1-2次；吹干沉淀后，加入TE溶解，-20℃保存；

所用DNA提取緩沖液為：Buffer緩沖液，包括1MTris-HCL?pH?8.0，0.5MEDTA?pH?8.0，5MNaCl，20％SDS，Na?Bisulfate；

SRAP-PCR反應體系：包括25ng模板DNA，25mM?Mg²⁺0.6μL，2.5mMdNTP?0.8μL，2μM?SRAP引物對1.0μL，0.5UTaqDNA聚合酶1.0μL，10×Buffer?1μL，ddH₂O?5.1μL，總體積為10μL；

SRAP-PCR擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性min，37℃退火1min，72℃延伸10sec，5個循環(huán)；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸10sec，35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min，4℃保存。