[發明專利]一種分離純化糖肽的方法

有效

• 申請號: 200810017386.1
• 申請日: 2008-01-10
• 公開（公告）號: CN101481402A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 李錚;陳超;孫士生;楊剛龍;王婷;孫秀璇;鄧瑋娜
• 申請（專利權）人: 陜西北美基因股份有限公司
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12P21/06
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司
• 代理人: 徐 平;康 凱

技術領域

本發明涉及一種分離純化糖肽的方法，尤其涉及一種用磁性微粒分離純化糖肽的方 法。

背景技術

蛋白質的糖基化修飾是最常見、最重要的蛋白質翻譯后修飾之一，目前已知哺乳動 物中一半以上的蛋白質是發生糖基化的。糖基化對蛋白質的結構和功能起著重要的作用， 蛋白質糖基化的程度及糖鏈結構的異常變化常常是癌癥及其他疾病發生的標志。

蛋白質糖基化程度和糖基化位點的變化可通過糖基化多肽(糖肽)的變化檢測出來。 近幾年，分離純化復雜樣品中糖肽的方法主要有凝集素法和肼化學法。復雜樣品如血清 以及細胞膜總蛋白等。

凝集素法是先用凝集素提取分離純化樣品中的糖蛋白，結合雙向電泳分離，再酶解 或直接酶解后再次用凝集素提取糖肽，之后質譜鑒定。該方法的主要缺點是：凝集素本 身的特異性結合特性會造成樣品分離純化的選擇性，不同的凝集素具有結合不同類型糖 蛋白的特生，因而單一凝集素不能一次提取分離純化樣品中的全部糖蛋白，且雙向電泳 工作費時、費力。

肼化學法是用肼化學分離純化提取糖蛋白，可一次性不選擇地分離純化幾乎所有類 型的糖蛋白/糖肽，然后用不同的方法依次洗脫。比如：用糖肽酶(PNGase?F)釋放N- 糖蛋白/糖肽，β-消除法釋放O-糖蛋白/糖肽，但該方法的主要缺點是：目前肼化學分 離純化糖肽時一般使用的固體載體是肼凝膠柱，分離速度緩慢，費時、費力，有些甚至 還需要離心機等分離設備，其次，肼凝膠柱的比表面積較小，所以糖蛋白分子的吸附容 量就較小，樣品接觸反應的機會較小，增大了糖蛋白與肼凝膠柱的偶聯時間。

發明內容

本發明的目的在于提供一種分離純化糖肽的方法，，其解決了背景技術中肼化學方法 分離純化糖肽程序復雜，分離純化反應時間長的技術問題。

磁性微粒簡稱磁粒，作為一種新的生物分子分離純化的載體，較非磁性載體具有較大 的比表面，對蛋白等反應速度快，吸附容量大，磁性分離簡單快速，巳逐漸應用于細胞、 核酸、蛋白質的分離、親和層析和放射免疫等生化技術領域。

本發明的技術方案如下：

一種分離純化糖肽的方法，其特殊之處在于：包括下述步驟

(1)制備肼功能化磁粒?

a清洗

取200毫克環氧化磁粒置于燒瓶中，用水清洗，清洗后將盛有懸浮液的燒瓶放到磁 性分離器上進行磁性分離，去掉上層不含磁粒的清液；

b反應修飾

向燒瓶中加入50毫升質量分數為5％的水合肼，將燒瓶置于水浴鍋中，向燒瓶中插 入攪拌器，再開啟攪拌器攪拌使磁粒和水合肼充分混合、反應，將環氧化磁粒修飾成肼 功能化磁粒；

(2)糖肽的分離純化

a清洗

反應完成后，將肼功能化磁粒用無水乙醇和水分別清洗，進行磁性分離，去掉上層 不含磁粒的清液；再用40毫升水重懸，重懸后將懸液保存備用；

b糖蛋白氧化

將一定量的蛋白樣品溶解或稀釋于偶聯緩沖液中，加入高碘酸鈉至其最終濃度10～ 15毫摩爾，常溫避光反應0.5～1.5小時；

c除高碘酸鈉

用G-25除鹽柱除掉未反應的高碘酸鈉；

d糖蛋白偶聯

將除鹽后的蛋白溶液加入到經偶聯緩沖液預處理過的肼功能化磁粒中，室溫振蕩偶聯 4～24小時，偶聯后磁性分離，去上清；用清洗液洗磁粒3～6次，以除去未共價結合的 蛋白；

e酶解得到糖肽

磁粒上的糖蛋白用5毫摩爾pH為7.8的三羧乙基磷溶于0.1摩爾的碳酸氫氨的溶液 中室溫還原30分鐘以上；然后加入碘代乙酰胺至其最終濃度為8～15mM，室溫繼續反 應30分鐘以上，磁性分離，去上清；用pH為7.8的碳酸氫氨溶液重懸磁粒，加入胰蛋 白酶至其最終濃度20毫克/升，37℃振蕩酶解4小時，補加相同量的胰蛋白酶，繼續酶 解10小時以上；

f清洗

磁粒用2摩爾/升氯化鈉溶液和無水乙醇先分別清洗，??再用pH為7.8的0.1摩爾/ 升碳酸氫氨溶液洗，直至非糖基化多肽完全去除；

e釋放糖肽

用pH為7.8的0.1摩爾/升碳酸氫氨溶液重懸磁粒，加入0.5微升的糖肽酶F，37℃ 振蕩酶解4小時，添加相同量的糖肽酶F，繼續反應4小時以上，完成糖肽的釋放；

一種分離純化糖肽的方法，其特殊之處在于：包括下述步驟