[發明專利]一種分離純化糖肽的方法

有效

• 申請號: 200810017386.1
• 申請日: 2008-01-10
• 公開（公告）號: CN101481402A
• 公開（公告）日: 2009-07-15
• 發明（設計）人: 李錚;陳超;孫士生;楊剛龍;王婷;孫秀璇;鄧瑋娜
• 申請（專利權）人: 陜西北美基因股份有限公司
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12P21/06
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司
• 代理人: 徐 平;康 凱

1.一種分離純化糖肽的方法，其特征在于，包括下述步驟

(1)制備肼功能化磁粒

a消洗

取200毫克環氧化磁粒置于燒瓶中，用水清洗，清洗后將盛有懸浮液的燒瓶放到磁 性分離器上進行磁性分離，去掉上層不含磁粒的清液；

b反應修飾

向燒瓶中加入50毫升質量分數為5％的水合肼，將燒瓶置于水浴鍋中，向燒瓶中插 入攪拌器，再開啟攪拌器攪拌使磁粒和水合肼充分混合、反應，將環氧化磁粒修飾成肼 功能化磁粒；

(2)糖肽的分離純化

a清洗

反應完成后，將肼功能化磁粒用無水乙醇和水分別清洗，進行磁性分離，去掉上層 不含磁粒的清液；再用40毫升水重懸，重懸后將懸液保存備用；

b糖蛋白氧化

將一定量的蛋白樣品溶解或稀釋于偶聯緩沖液中，加入高碘酸鈉至其最終濃度10～ 15mM，常溫避光反應0.5～1.5小時；

c除高碘酸鈉

用G-25除鹽柱除掉未反應的高碘酸鈉；

d糖蛋白偶聯

將除鹽后的蛋白溶液加入到經偶聯緩沖液預處理過的肼功能化磁粒中，室溫振蕩偶聯 4～24小時，偶聯后磁性分離，去上清；用清洗液洗磁粒3～6次，以除去未共價結合的 蛋白；

e酶解得到糖肽

磁粒上的糖蛋白用5mM、pH為7.8的三羧乙基磷溶于0.1M的碳酸氫氨的溶液中室 溫還原20分鐘以上；然后加入碘代乙酰胺至其最終濃度為8～15mM，室溫繼續反應 30分鐘以上，磁性分離，去上清；用pH為7.8的碳酸氫氨溶液重懸磁粒，加入胰蛋白 酶至其最終濃度20毫克/升，37℃振蕩酶解4小時，補加相同量的胰蛋白酶，繼續酶解 10小時以上；

f清洗

磁粒用2摩爾/升氯化鈉和無水乙醇先分別清洗，再用pH為7.8的0.1摩爾/升碳酸 氫氨溶液洗，直至非糖基化多肽完全去除；

g釋放糖肽

用pH為7.8的0.1摩爾/升碳酸氫氨溶液重懸磁粒，加入0.5微升的糖肽酶F，37℃ 振蕩酶解4小時，添加相同量的糖肽酶F，繼續反應4小時以上，完成糖肽的釋放。